瘦素在心衰患者心肌中的表達及其與心肌炎癥反應的相關性

王夢龍，劉劍芳，劉夢林，馮 穎，袁文慧，萬 軍

(武漢大學人民醫院心血管內科，湖北 武漢 430060)

瘦素在心衰患者心肌中的表達及其與心肌炎癥反應的相關性

王夢龍，劉劍芳，劉夢林，馮 穎，袁文慧，萬 軍

(武漢大學人民醫院心血管內科，湖北 武漢 430060)

目的 探討瘦素(Leptin)在心力衰竭患者心肌中的表達及意義。方法收集行心臟移植的心力衰竭患者左心室心肌樣本20例，同時收集配型不成功的供體心肌樣本(對照組)9例，分別檢測心肌組織中Leptin、B型利鈉肽(NPPB)、白介素6(IL-6)及腫瘤壞死因子(TNF-α)的表達水平，并分析Leptin與NPPB、IL-6及TNF-α含量的相關性。結果與對照組比較，心衰患者心肌組織Leptin mRNA和蛋白水平明顯上調(P＜0.01)，NPPB、IL-6及TNF-αmRNA水平升高；相關分析發現心衰患者心肌Leptin mRNA表達水平與心力衰竭嚴重程度(NPPB)、心肌炎癥反應程度(IL-6和TNF-α)均呈正相關(r=0.804，P＜0.01；r=0.457，P＜0.05；r=0.336，P＜0.05)。結論心衰患者心肌組織Leptin表達水平增高，且與心肌炎癥反應程度相關；Leptin可能通過調節心肌炎癥反應參與心衰后心肌重構過程。

瘦素；心力衰竭；炎癥反應；心肌重構

瘦素(Leptin)是最早被發現的脂肪細胞合成和分泌的細胞因子[1]，具有調節能量代謝的作用，血漿Leptin濃度與體重指數和肥胖程度正相關[2]。隨后證實其他組織如腦、骨骼肌、胎盤、心臟等組織同樣可以合成和分泌Leptin[3-4]，通過自分泌和旁分泌的方式調節臟器功能。現有的研究提示血清Leptin水平與心肌梗死[5]、高血壓病[6]、卒中[7]等心血管不良事件發生率相關。心衰患者循環血Leptin濃度升高，與心衰患者循環血炎癥反應程度相關[8-9]，基礎研究證實缺血再灌注等病理刺激可以誘導心肌Leptin表達[10]，但Leptin在心衰患者心肌組織中的表達及其與心肌炎癥反應程度之間關系的報道甚少。因此本研究擬通過收集心衰患者左心室心肌組織，檢測心肌Leptin和炎癥指標表達水平并分析其相關性，以明確Leptin在心衰患者心肌重構病理生理過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 心肌標本收集 參照之前方法[11]收集2012年9月至2013年12月期間因嚴重心功能不全行心臟移植患者的左心室心肌組織，所有心衰患者的診斷均符合2012年歐洲心臟病協會發布的心衰診斷及治療指南[12]。同時收集配型不成功的供體心臟左心室心肌組織作為對照組，排除有嚴重肝腎功能不全、心臟病史的供體標本。所有標本均取左室前壁心肌組織，以最大程度保證樣本的均一性。心肌組織分離后迅速放至液氮中速凍，隨后轉移至-80℃冰箱保存備用。

1.2 Real-time PCR檢測心肌Leptin、B型利鈉肽(NPPB)、白介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子(TNF-α) mRNA水平 Trizol法提取心肌組織總RNA，Nanodrop 2000測定RNA濃度，取2 μg RNA反轉錄成cDNA。利用羅氏Light Cycler 480 Real-time PCR儀進行相應指標的特異性擴增，以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCT法進行定量分析，相應試劑購于Roche公司。目標基因與內參基因的特異性引物序列見表1，引物由北京擎科新業生物技術有限公司合成。反應條件為：95°C預變性10 min；95°C變性10 s、60°C退火10 s、72°C延伸20 s，共40個循環。

表1 實時熒光定量PCR特異性引物序列

1.3 Western blot檢測心肌Leptin蛋白水平 取適量心肌組織提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，按照40 μg/孔道上樣，行聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結束后將凝膠中的蛋白轉移到PVDF膜上，之后將PVDF膜置于含5%脫脂奶粉的TBS中室溫封閉1 h，封閉后用TBST洗膜5 min，共3次。將PVDF膜置于Leptin一抗(Abcam，1:1 000)中4℃孵育過夜。次日使用相應種屬的二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜后用Bio-RAD凝膠成像系統檢測目的條帶，以GAPDH為內參分析Leptin表達水平。

1.4 統計學方法 計量數據以均數±標準差(x-±s)表示，采用SPSS18.0軟件進行統計學處理，組間比較采用獨立樣本t檢驗，Leptin與NPPB、IL-6及TNF-α相關性采用Spearman相關分析，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料 共收集到心衰患者心肌組織20例，均為男性，病因包括擴張型心肌病(DCM，12例)和缺血性心肌病(ICM，8例)，同時共收集到供體心肌組織(對照組)9例。心衰組患者平均年齡大于對照組[(53.55±10.84)vs(38.11±7.70)，t=-4.415，P＜0.01]。心衰組左室舒張末期內徑為(67.90±9.69)mm，平均射血分數為(28.80±5.95)%。

2.2 Leptin mNRA及蛋白表達水平 與對照組相比，心衰組患者心肌中Leptin mRNA表達水平明顯上調(升高約4.7倍)，差異具有統計學意義(t=-8.653，P＜0.01)。同樣，Western blot證實Leptin蛋白在心衰患者心肌中表達水平明顯高于對照組(t=-11.607，P＜0.01，圖1)。

2.3 Leptin mRNA水平與NPPB、IL-6及TNF-α的相關性 NPPB是編碼B型利鈉肽的基因，其表達水平可以反映心衰嚴重程度。NPPB mRNA表達在心衰組心肌中明顯上調(圖2)，且心衰患者心肌Leptin mRNA水平與NPPB mRNA水平明顯正相關(r=0.804，P=0.002)。IL-6、TNF-αmRNA水平一定程度上反映心肌炎癥反應程度，在心衰發生后心肌中兩者表達水平均增高(圖2)，Spearman關聯分析發現Leptin mRNA與IL-6、TNF-αmRNA水平均呈正相關關系(r=0.457，P＜0.05；r=0.336，P＜0.05)。

圖1 心衰組與對照組心肌Leptin表達水平

注：a心衰組與對照組比較，P＜0.01

圖2 心衰組與對照組心肌NPPB、IL-6及TNF-α mRNA表達水平

3 討論

心力衰竭發生后心肌出現一系列結構與功能的改變，稱為心肌重構。心肌重構的發生機制尚不完全清楚，氧化應激、炎癥反應、內質網應激、自噬等多種病理生理過程均參與了心肌重構過程。脂肪細胞因子如脂聯素、Leptin等具有多功能效應的細胞因子在心血疾病中的作用受到越來越多的關注。

早期的研究發現心衰患者血清Leptin水平升高，與心衰患者胰島素抵抗程度相關[9]，提示Leptin可能在心衰患者能量代謝過程中起重要作用。隨著研究的深入，血清Leptin水平被認為是心衰診斷的一個指標[13]，可以反映心衰患者炎癥反應程度[14-15]。有氧運動可以降低冠心病風險，可能與有氧運動降低患者血清Leptin、TNF-α等因子水平有關[16]。基礎研究證實Leptin在心肌肥厚和其他心血管疾病模型中起重要作用[17]。Leptin刺激增加乳鼠心肌細胞表面面積，促進胚胎基因的表達，通過p38途徑參與心肌細胞肥大過程[18]。另外，Leptin還參與AngⅡ刺激和內皮素刺激引起的心肌肥厚過程[19]。而抑制Leptin表達可以降低IL-6、IL-1β、TNF-α等炎癥因子水平，改善心肌細胞和心臟收縮功能[15，20]。這些研究均提示心肌Leptin在心肌病理生理過程中具有重要作用。

我們的研究發現：與對照組相比，心衰患者心肌中Leptin mRNA和蛋白表達水平增高，炎癥反映相關指標IL-6、TNF-αmRNA表達水平也增高，關聯分析發現Leptin水平與心力衰竭嚴重程度和炎癥反應程度正相關，這與其他學者在血清標本中的研究結果一致[14-15]。我們推測心肌細胞合成和分泌的Leptin可能通過調節炎癥反應過程參與心衰后心肌重構過程。

本研究尚存在一些不足，首先，納入研究的標本例數較少，年齡差異較大；其次，我們的研究僅提示心肌Leptin表達水平與心肌炎癥反應程度相關，但該結果并不能證實Leptin水平與心肌炎癥反應及心肌重構之間的因果關系，尚需進一步動物或細胞實驗驗證相關結果。總體來講，心肌Leptin可能通過調節炎癥反應參與心衰后心肌重構過程中，但具體機制尚需進一步研究。

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Expression of Leptin in the myocardium of patients with heart failure and its relationship with inflammation.

WANG Meng-long,LIU Jian-fang,LIU Meng-lin,FENG Ying,YUAN Wen-hui,WAN Jun.Department of Cardiology, Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,Hubei,CHINA

ObjectiveTo investigate the expression and significance of Leptin in the myocardium of patients with heart failure and its relationship with inflammation.MethodsLeft ventricular tissues were collected from 20 transplanted hearts with heart failure(n=20,the study group)and 9 donor hearts which were not matched with patients(n=9,the control group).Expression levels of Leptin,natriuretic peptide precursor B(NPPB),interleukin-6 (IL-6)and tumor necrosis factor(TNF-α)in the myocardium were detected.Spearman analysis was applied to test the correlations between mRNA levels of Leptin and NPPB,IL-6,TNF-α.ResultsCompared with control group,the mRNA and protein levels of Leptin in the study group was significantly increased(P＜0.01).Also,the mRNA levels of NPPB,IL-6,TNF-αwere significantly higher than those in the control group.The mRNAlevels of Leptin was positively correlated with NPPB,IL-6 and TNF-αmRNA levels in the myocardium of patients with heart failure(r=0.804,P＜0.01;r=0.457,P＜0.05;r=0.336,P＜0.05).ConclusionThe expression of Leptin is increased at both mRNA and protein levels in the myocardium of patients with heart failure,and Leptin levels are positively correlated with the severity of inflammation.Leptin may play an important role during cardiac remodeling through regulating inflammation process.

Leptin;Heart failure;Inflammation;Cardiac remodeling

R541.6

A

1003—6350（2015）14—2040—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.14.0738

2015-04-15)

國家自然科學基金(編號：81170208)；湖北省科技廳項目(編號：302-131725)

萬 軍。E-mail：wanjun1963@126.com