酶法提取鮑魚內臟蛋白質工藝的研究

郭 芳，方 婷，林 杰，陳錦權

（1.呂梁學院 生命科學系，山西 呂梁 033000；2.福建農林大學 食品科學學院，福建 福州 350002）

鮑魚（abalone）是海洋軟體單殼貝類，屬原始腹足目、鮑科[1-2]。其營養價值極高，富含多種生物活性因子[3]。眾多研究表明，鮑魚的內臟中存在具有消炎、抗腫瘤、調節免疫、抗應激等功效的物質[4-8]。水解動物蛋白（hydrolyzed animal protein，HAP）是指蛋白質經過生物催化等方法處理而得到的產物。HAP富含人體必需氨基酸，營養高，性能優，不含膽固醇，因蛋白含量高（其中多為小分子多肽，易溶于水）且人體的吸收利用率高等特點而被評為優質的蛋白源[9]。

工業上主要通過酸法、堿法和酶法等工藝生產HAP。相關研究表明，對不同的動物蛋白原材料，采用不同種類的水解蛋白酶，調整加酶量及其他相關酶解參數，可以生產出優質的HAP[10]。

鮑魚內臟中富含蛋白質，但是隨著鮑魚養殖業、加工業的迅速發展，大量的鮑魚臟器被當作加工廢棄物而堆積起來，極容易變質腐爛，造成了經濟損失的同時也會引來環境污染的問題。因此本試驗以鮑魚內臟為原料，采用胰蛋白酶對提取內臟中蛋白質的反應條件進行了優化，旨為鮑魚臟器蛋白資源的綜合利用提供理論和試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮑魚內臟：漳州歐圣食品有限公司；胰蛋白酶（4 000 U/g）：南寧東恒華道生物科技責任有限公司。

1.2 儀器與設備

L-550臺式低速離心機：長沙湘儀離心機有限公司；DHO-9240A電熱恒溫鼓風干燥機：上海精密試驗設備有限公司；FA1004電子天平：上海精天電子儀器有限公司；PHSJ-SF實驗室PH計：上海精科有限公司；UV6300PC紫外可見光分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；ATN-300 全自動定氮儀：上海洪紀儀器設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 酶法提取工藝[11]

凍藏鮑魚內臟解凍→打漿→過膠體磨→過高壓脈沖電場→酒精脫色→鮑魚內臟預處理液→加水勻漿→調整pH值→酶解→加熱滅酶（沸水浴10 min）→冷卻離心（4 000 r/min、20 min）→鮑魚內臟酶解液

1.3.2 鮑魚內臟蛋白質分離提取的單因素試驗

以總氨基酸態氮含量為指標，分別考察料液比、pH值、酶解溫度、提取時間、酶量等條件對鮑魚內臟蛋白提取效果的影響。

1.3.3 鮑魚內臟蛋白質分離提取的響應面優化試驗

在單因素試驗的基礎上，采用Box-Benhnken試驗設計及響應面分析法，探討pH值、酶用量、溫度、料液比及其交互作用對提取效果的影響，并建立提取率和各影響因素間的數學模型，試驗因素與水平見表1。

表1 鮑魚內臟蛋白質分離提取響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface design for abalone visceral protein extraction optimization

1.3.4 測定方法

蛋白質水解度（degree of hydrolysis，DH）：按照參考文獻[12]的方法測定；總氨基酸態氮含量：按照參考文獻[13]的方法測定；蛋白質含量：按照參考文獻[14]的方法測定；氮回收率按照參考文獻[15]的方法計算。

2 結果與分析

2.1 單因素變化對鮑魚內臟蛋白質提取效果的影響

2.1.1 料液比對鮑魚內臟蛋白質提取效果的影晌

在胰蛋白酶添加量為0.15%，溫度為55 ℃，pH值為7.0，時間為4 h的條件下，配制不同料液比，分別進行蛋白提取試驗，結果見圖1。

由圖1可知，總氨基酸態氮含量隨料液比的增加呈下降趨勢，料液比為1∶4（g∶mL）時，總氨基酸態氮含量最大，隨著料液比的增大，提取液總氨基酸態氮含量急劇下降。當料液比＞1∶4（g∶mL）以后，減小的速率逐漸變小，最后趨于穩定。但在實際操作中過高濃度的待酶解液會稀釋所得的蛋白提取液的濃度，不利于后續的純化操作[16]，所以料液比選為1∶4（g∶mL）。

2.1.2 pH值對鮑魚內臟蛋白質提取效果的影響

在胰蛋白酶添加量為0.15%，溫度為55 ℃，料液比為1∶4（g∶mL），時間為4 h的條件下，分別在不同pH值條件下進行蛋白提取試驗，結果見圖2。

圖2 p H值對鮑魚內臟蛋白質提取效果的影響Fig.2 Effect of pH on extraction yield of abalone visceral protein

由圖2可知，鮑魚內臟中蛋白質提取率的波動程度受pH的影響比較大。pH值在5～7的范圍內，總氨基酸態氮含量隨著pH的增大而增大，pH＞7時，總氨基酸態氮含量呈下降的趨勢。當pH值為7時，總氨基酸態氮含量最高而且條件最溫和，有利于蛋白質活性的保存，所以選擇最適pH值為7。

2.1.3 酶解溫度對鮑魚內臟蛋白質提取效果的影響

在胰蛋白酶添加量為0.15%，pH值為7.0，料液比為1∶4（g∶mL），時間為4 h的條件下，分別在不同溫度條件下進行蛋白提取試驗，結果見圖3。

圖3 提取溫度對鮑魚內臟蛋白質提取效果的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction yield of abalone visceral protein

酶的催化條件具有特異性，不同的酶在特定的溫度范圍內才能發揮最大的催化作用。因此，適度提高溫度可提升酶的催化活力；但酶的化學本質是蛋白質，高溫會使蛋白質變性，同樣影響酶法提取反應。由圖3可知，在酶解溫度為30～50 ℃的范圍內，總氨基酸態氮含量隨溫度升高而升高；酶解溫度為50 ℃時，總氨基酸態氮含量達到最高值；酶解溫度高于50 ℃后，總氨基酸態氮含量隨溫度的升高而逐漸下降。因此選擇最適的酶解溫度50 ℃。

2.1.4 提取時間對鮑魚內臟蛋白質提取效果的影響

在胰蛋白酶添加量為0.15%，pH值為7.0，酶解溫度為55 ℃，料液比為1∶4（g∶mL）的條件下，分別在不同提取時間下進行蛋白提取試驗，結果見圖4。

圖4 酶解時間對鮑魚內臟蛋白質提取效果的影響Fig.4 Effect of enzymolysis time on extraction yield of abalone visceral protein

由圖4可知，在1～4 h范圍內，提取時間越長，總氨基酸態氮含量越高，但增長速率在3 h后逐漸降低，提取時間4 h時總氨基酸態氮含量達到最大，＞4 h之后提取率呈現急劇降低的趨勢，這可能是由于提取時間過長引起了蛋白質的過度降解[17]。4 h以后胰蛋白酶的酶解作用已經達到充分狀態，繼續延長時間反而引起鮑魚內臟中其他物質分解影響蛋白質的浸出，所以認為較為適宜的提了以時間是4 h。

2.1.5 酶用量對鮑魚內臟蛋白質提取效果的影響

在料液比為1∶4（g∶mL）時，酶解溫度為55 ℃，pH值為7，經4 h 酶解的條件下，測定不同胰蛋白酶用量對總氨基酸態氮含量（Y）的影響，結果見圖5。

圖5 酶用量對鮑魚內臟蛋白質提取效果的影響Fig.5 Effect of enzyme addition on extraction yield of abalone visceral protein

由圖5可知，胰蛋白酶用量為0.1%～0.2%范圍內，隨著酶用量的增加，總氨基酸態氮含量快速增加；超過0.2%后，酶用量再增加時，總氨基酸態氮含量變化不明顯，所以確定最佳酶用量為0.2%。

2.3 響應面試驗

2.3.1 試驗結果與分析

試驗設計方案和結果見表2。

表2 鮑魚內臟蛋白質分離提取響應面試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of response surface experiment for abalone visceral protein extraction optimization

2.3.2 模型的建立及顯著性檢驗

響應數據的方差分析結果見表3，其中F模型=31.09，對應P＜0.01，表明回歸模型極其顯著。失擬項F=1.31，對應P＞0.05，不顯著，表明此模型擬合較好。

表3 顯著性檢驗結果Table 3 Significant analysis results of the model

利用Design Expert軟件，獲得擬合后的鮑魚內臟蛋白總氨基酸態氮含量對編碼自變量酶解時間、酶解溫度、料液比、酶用量的二次多項回歸方程：

2.3.3 鮑魚內臟蛋白質最佳提取工藝條件

根據二次回歸數學模型進行優化，獲得最優鮑魚內臟蛋白提取工藝參數為酶添加量0.15%，提取時間為4 h，料液比為1∶4（g∶mL），酶解溫度為54.88 ℃，pH值為7.08，此時的鮑魚內臟酶解液總氨基酸態氮含量為165 mg/100 mL。為方便試驗，優化工藝參數為酶添加量0.15%，提取時間為4 h，料液比為1∶4（g∶mL），酶解溫度為55 ℃，pH值為7。此時測得鮑魚內臟酶解液總氨基酸態氮含量為163 mg/100 mL，蛋白質含量為1.478 g/100 g，說明該模型可行。此條件下水解度為51.9%，氮回收率為38.1%。

3 結論

在單因素試驗的基礎上，應用響應面回歸分析法對酶法提取鮑魚內臟蛋白質的工藝條件進行了優化?？疾炝藀H值、酶解溫度、胰蛋白酶添加量和提取時間4個因素對提取工藝的影響，通過分析可以發現，溫度是顯著性的因素，并確定了酶法提取鮑魚內臟蛋白質的最佳提取工藝條件為pH值為7，酶解溫度為55 ℃，提取時間為4h，胰蛋白酶添加量0.15%，此條件下得到的酶解鮑魚內臟酶解液總氨基酸態氮含量為163 mg/100 mL，蛋白質的水解度為51.9%，氮回收率為38.1%，這對鮑魚內臟蛋白質資源的綜合利用能提供一定的試驗依據。

圖6 各因素相互作用對總氨基酸態氮影響的響應面和等高線Fig.6 Response surface plots and contour line of effects of interaction between solid liquid ratio,enzyme addition,pH and temperature on total amino nitrogen content

[1]李太武，蘇秀榕，丁明進，等.鮑的生物學[M].北京：科學出版社，2004.

[2]KRESGE N,VACQUIER V D,STOUT C D.Abalone lysine:the dissolving and evolving sperm protein[J].Bio Essays,2001,23(1):95-103.

[3]易美華，王錫彬.海南鮑營養成分及活性物質的分析研究[J].農牧產品開發，1997（12）：34-38.

[4]蘇勇昌，劉淑集，王 茵，等.鮑魚內臟多糖的提取及其抗氧化活性研究[J].吉林農業，2010（10）：170-171.

[5]朱莉莉，孫黎明，李冬梅，等.鮑魚內臟蛋白多糖體內對H22 肝癌的抑制作用[J].營養學報，2009，31（5）：478-481，485.

[6]王蒞莎，朱蓓薇，孫黎明，等.鮑魚內臟多糖的體外抗腫瘤和免疫調節活性研究[J].大連工業大學學報，2008，27（4）：289-293.

[7]DIAS P F,SIQUEIRA J M,VENDRUSCOLO L F,et al.Antiangiogenic and antitumoral properties of a polysaccharide isolated from the seaweedSargassum stenophyllum[J].Cancer Chemoth Pharm,2005,56(4):436-446.

[8]彭汶鐸，陳啟亮，趙金華.鮑魚酶解提取渡的生理活性[J].中國食品衛生雜志，2004，16（3）：218-220.

[9]王志民，袁永俊，張艷萍，等.水解動物蛋白的酶法應用[J].四川工業學院學報，1999（2）：92-94.

[10]李志軍，張 明.水解蛋白的研究與應用[J].食品研究與開發，2003，24（4）：42-44.

[11]陳錦權.一種分離純化鮑魚蛋白的方法：中國，CN102178027[P].2011.09.14.

[12]ADLER-NISSEN J.Enzymic hydrolysis of food proteins[M].London:Elsevier Applied Science Publishers Ltd.1986.

[13]何雪蓮.羅非魚加工下腳料發酵生產魚露的研究[D].廣州：華南熱帶農業大學碩士論文，2007.

[14]中華人民共和國衛生部.GB 5009.5—2010 食品中蛋白質的測定方法[S].北京：中國標準出版社，2010.

[15]楊 晉，陶寧萍，王錫昌.文蛤的營養成分分析及其用于海味香精的酶解液制備[J].食品工業科技，2007，28（4）：146-149.

[16]馮小黎，金業濤，蘇志國.分離純化中蛋白質的不穩定性及其對策[J].生物工程進展，2000，20（3）：67-70.

[17]肖 連，冬李彗，星減晉.啤酒糟中蛋白質的酶法提取及功能特性研究[J].中國釀造，2008，27（19）：36-39.