姜黃素對(duì)心臟成纖維細(xì)胞增殖的研究

楊蕙宇

(西安醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院技能教研室，西安 710021)

姜黃素對(duì)心臟成纖維細(xì)胞增殖的研究

楊蕙宇

(西安醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院技能教研室，西安 710021)

目的:探究姜黃素在AngII誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞大量增殖和CTGF、PAI-1過表達(dá)中的影響，探討姜黃素與心臟成纖維細(xì)胞增殖的關(guān)系。方法:心臟成纖維細(xì)胞原代的培養(yǎng)，分別用倒置顯微鏡及免疫組織化學(xué)法對(duì)原代心臟成纖維細(xì)胞進(jìn)行監(jiān)測(cè)，用MTT法測(cè)定不同濃度姜黃素(0～100 μmol/L)對(duì)心臟成纖維細(xì)胞活性的影響，用MTT法檢測(cè)不同濃度姜黃素對(duì)心臟成纖維細(xì)胞增殖能力的影響，用real-time PCR檢測(cè)CTGF、PAI-1mRNA，用western-blot法分析不同濃度姜黃素對(duì)各組心臟成纖維細(xì)胞CTGF、PAI-1表達(dá)的影響。結(jié)果:在0～60 μmol/L范圍內(nèi)，姜黃素未顯示明顯的細(xì)胞毒性，因此在后續(xù)試驗(yàn)中我們選擇5、10、30 μmol/L濃度姜黃素進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)說明姜黃素可以有效的抑制AngII誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞增殖，并具有濃度依賴性，可以有效地抑制AngII誘導(dǎo)的CTGF和PAI-1表達(dá)。結(jié)論:姜黃素能夠有效地抑制AngII誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞過度增殖和CTGF、PAI-1 mRNA與蛋白的過表達(dá)，從而起到抗增殖作用。

姜黃素;血管緊張素-II;心臟成纖維細(xì)胞;纖維化

姜黃素是一種天然色素類物質(zhì)，富含于姜科植物塊莖中，是一種被廣泛使用的調(diào)味品。此外，很早姜黃素就被收入中國(guó)和印度的草本方劑中，用于治療多種疾病?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，姜黃素具有抗炎［1］、抗腫瘤、抗纖維化和心血管保護(hù)［2］等多種生物學(xué)效用。目前已有試驗(yàn)證實(shí)，在多種常見致纖因素導(dǎo)致的肺部和腎臟等器官纖維化病變中，姜黃素均顯示出顯著的抗纖維化作用。Smith MR［3］等發(fā)現(xiàn)，姜黃素可以抑制肺部成纖維細(xì)胞的增殖，從而減輕博來霉素誘導(dǎo)的肺部纖維化。姜黃素還可以通過抑制TGF-β通路的激活和上調(diào)抗炎因子HO-1的表達(dá)，減輕腎臟纖維化的程度［4］。迄今為止，姜黃素對(duì)心臟纖維化的發(fā)病作用尚不明確。本研究我們擬在基因和蛋白的水平研究姜黃素對(duì)AngII誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞增殖的能力，以探討姜黃素與心臟纖維化的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑

出生1～2 d的SD大鼠雌雄不限，由西安交通醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。姜黃素粉末純品購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，兔抗大鼠PAI-1多克隆抗體由美國(guó)Abcom公司提供，兔抗大鼠CTGF多克隆抗體由美國(guó)Santa Cruz公司提供。

1.2 研究方法

1.2.1 心臟成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng) 選擇出生1～2 d的SD大鼠乳鼠15只分離心臟組織，4℃ DHanks中反復(fù)漂洗，摘取左心室部分約1～2 mm3大小的組織塊，用5 g/L的胰酶對(duì)其消化;采用差速貼壁法分離心臟成纖維細(xì)胞。使用3～7代的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并用倒置顯微鏡對(duì)原代培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行鑒定，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)。

1.2.2 姜黃素溶液配制 姜黃素粉末純品購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，使用DMSO溶解，制成10 mmol/ L保存濃度，放置于-20℃冰箱內(nèi)長(zhǎng)期儲(chǔ)存，使用時(shí)再稀釋成相應(yīng)濃度。

1.2.3 細(xì)胞活性測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的心臟成纖維細(xì)胞，以4×104個(gè)/mL濃度接種于96孔板中，每孔150 μL。細(xì)胞貼壁融合80%～90%后，以不同濃度(10、20、40、60、80、100 μmol/ L)的姜黃素處理24 h棄去培養(yǎng)液，每孔中加入MTT (5 mg/mL)20 μL，繼續(xù)孵育4 h，吸去上清液，每孔中再加入150 μL的DMSO溶解結(jié)晶顆粒，490 nm測(cè)定各組吸光度值(OD490)。以正常對(duì)照組細(xì)胞活力為100%，其余各組細(xì)胞活力按以下公式計(jì)算:活細(xì)胞率(%)=。

1.2.4 姜黃素對(duì)AngII刺激的心臟成纖維細(xì)胞增殖能力的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的CFs細(xì)胞，以4×104個(gè)/mL濃度接種于96孔板中，每孔150 μL。細(xì)胞貼壁融合為80% ～90%后，以不同濃度(5、10、30 μmol/L)的姜黃素預(yù)處理2 h，再改用AngII(100 nmol/L)孵育1～5 d。棄去培養(yǎng)液，每孔中加入MTT(5 mg/mL)20 μL，繼續(xù)孵育4 h吸去上清液，每孔中再加入150 μL的DMSO溶解結(jié)晶顆粒，490 nm測(cè)定各組吸光度值(OD490)。以正常對(duì)照組細(xì)胞活力100%，按細(xì)胞活力公式計(jì)算:活細(xì)胞率(%)==97.91%。

1.2.5 熒光定量PCR(real-time PCR)反應(yīng)引物設(shè)計(jì):依據(jù)GenBank提供的大鼠CTGF、PAI-1和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的核酸序列，使用Desiner V 4.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，由南京金絲瑞生物有限公司合成。引物序列 CTGF forward:5’-CACCCGGGTTACCAATGACAA-3’;reverse:5’-AGCCCGGTAGGTCTTCACACTG-3’。GAPDH引物序列用于內(nèi)對(duì)照:forward，5’-GACAACTTTGGCATC GTGGA-3’;reverse，5’-ATGCAGGGATGATGTTCT GG-3’。用上述引物進(jìn)行PCR，95℃，5 min 95℃，15 s 55℃，15 s 72℃，30 s 45個(gè)循環(huán)。

1.2.6 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western-blot) 總蛋白提取:蛋白濃度測(cè)定SDS-PAGE電泳、制膠、加樣和電泳、轉(zhuǎn)膜，電泳結(jié)束后一抗孵育，4℃孵育過夜。二抗孵育使用TBST對(duì)PVDF膜進(jìn)行清洗，每次8 min，共4次。配制相應(yīng)二抗(1∶2000)，室溫下孵育2 h?；瘜W(xué)發(fā)光使用Quantity One圖像分析軟件，對(duì)膠片進(jìn)行灰度掃描，以control為對(duì)照，其他各組灰度按照control組倍數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 姜黃素組與對(duì)照組進(jìn)行方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CFs細(xì)胞的鑒定

普通形態(tài)學(xué)和免疫組化法對(duì)原代CFs細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，CFs細(xì)胞纖維黏連蛋白染色陽(yáng)性，在胞質(zhì)有均勻分布的黃色絲狀物質(zhì)。對(duì)CFs細(xì)胞進(jìn)行肌動(dòng)蛋白染色，無(wú)顯色現(xiàn)象。

2.2 不同濃度姜黃素對(duì)CFs細(xì)胞活性的影響

圖1顯示，為排除姜黃素可能的細(xì)胞毒性影響，我們使用 MTT法測(cè)定不同濃度姜黃素(0～100 μmol/L)對(duì)CFs細(xì)胞活性的影響。因此，在后續(xù)試驗(yàn)中我們選擇5、10、30 μmol/L濃度姜黃素對(duì)CFs細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)。

圖1 不同濃度姜黃素對(duì)CFs細(xì)胞毒性的影響

2.3 不同濃度姜黃素對(duì)CFs細(xì)胞增殖能力的影響

圖2顯示，使用MTT法對(duì)各組細(xì)胞增殖能力進(jìn)行檢查。結(jié)果提示，姜黃素可以有效地抑制AngII誘導(dǎo)的CFs細(xì)胞增殖作用。

圖2 不同濃度姜黃素對(duì)AngII刺激的CFs細(xì)胞增殖能力影響

2.4 不同濃度姜黃素對(duì)CFs細(xì)胞CTGF、PAI-1表達(dá)的影響

圖3顯示，由CFs細(xì)胞通過自分泌和旁分泌途徑釋放的CTGF和PAI-1，可以顯著增強(qiáng)自身及附近CFs細(xì)胞增殖和膠原分泌能力。結(jié)果提示，姜黃素可以有效抑制AngII誘導(dǎo)的CTGF和PAI-1表達(dá)，起到一定的抗增殖作用。

3 討論

在原發(fā)性高血壓、心肌梗塞、瓣膜性心臟病等常見心臟疾病的發(fā)展過程中，均伴有心臟纖維化的病理性改變。心臟成纖維細(xì)胞(CFs)的過度增殖和聚集、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的沉積是心臟纖維化的主要病理學(xué)特征。在心臟纖維化過程中，伴隨激素-體液內(nèi)成分濃度的改變，致纖因子分泌顯著增加。AngII已被證實(shí)是強(qiáng)有力的致纖因子，據(jù)此本實(shí)驗(yàn)中我們選取AngII對(duì)CFs細(xì)胞進(jìn)行刺激。CTGF通過刺激CFs增殖、增加CFs細(xì)胞I和III型膠原分泌、增強(qiáng)細(xì)胞遷移等方式促進(jìn)心臟纖維化的發(fā)展。PAI-1已被證實(shí)，可以通過增強(qiáng)TGF-β/Smad通路的磷酸化，增強(qiáng)腎小球細(xì)胞的增殖能力［5］。在心臟纖維化的動(dòng)物模型中，也發(fā)現(xiàn)PAI-1的表達(dá)明顯升高。在肝臟、肺臟等器官的纖維化過程中，CTGF可以誘導(dǎo)處于原始狀態(tài)的多種間質(zhì)細(xì)胞向成熟狀態(tài)發(fā)展［6-7］。

圖3 不同濃度姜黃素對(duì)CFs細(xì)胞CTGF和PAI-1 mRAN和蛋白表達(dá)的影響

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，姜黃素具有抗炎、抗腫瘤、抗纖維化和心血管保護(hù)等多種生物學(xué)效用。目前已經(jīng)有試驗(yàn)證實(shí)，在多種常見致纖因素導(dǎo)致的肺部和腎臟等器官纖維化病變中，姜黃素均顯示出顯著的抗纖維化作用。并通過上調(diào) cathepsins K和 cathepsins L，抑制成纖維細(xì)胞增殖和遷移能力，增加成纖維細(xì)胞凋亡比例，從而減輕博來霉素誘導(dǎo)的肺部纖維化。在本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果中我們首次發(fā)現(xiàn)，姜黃素能夠顯著抑制AngII誘導(dǎo)的CFs細(xì)胞增殖能力，并具有濃度依賴性。此外，姜黃素還能減少CFs細(xì)胞CTGF和PAI-1分泌。這些結(jié)果提示，姜黃素對(duì)于可能對(duì)AngII誘導(dǎo)的心臟纖維化具有一定的抑制作用。

總之，姜黃素能夠顯著抑制AngII誘導(dǎo)的CFs細(xì)胞增殖能力，并具有濃度依賴性。此外，姜黃素還能夠抑制AngII誘導(dǎo)CFs細(xì)胞CTGF和PAI-1的分泌。這些結(jié)果提示，姜黃素對(duì)于可能對(duì)AngII誘導(dǎo)的心臟纖維化具有一定的抑制作用。此研究對(duì)心臟纖維化的預(yù)防與治療提供了新的觀點(diǎn)。

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Influence of curcumin on proliferation of fibroblasts into heart

YANG Hui-Yu
(Clinical Medical College，Xi’an Medical University，Xi'an 710021，China)

objective:Explore curcumin proliferate and CTGF，PAI-1 overexpression in AngII-induced effects on cardiac fibroblasts.Explore the relationship between curcumin and the proliferation of cardiac fibroblasts.Method:The primary cultured cardiac fibroblasts，respectively by inverted microscope and immunohistochemical method for primary cardiac fibroblasts were monitored.Determined by MTT method is used to test different concentrations of curcumin(0～100 mu mol/L)effect on the activity of cardiac fibroblasts.The effect of different concentration of Cur(0～100 μmol/L)on the cell proliferation ability of cardiac fibroblasts was measured by MTT assay.The levels of mRNA and protein of CTGF，PAI-1，were measured by real-time PCR and western-blotting.Result:Curcumin exhibits no cellular toxicity on cardiac fibroblasts at the concentration between 0～60 μmol/L.In our study，we chose the concentration of 5，10，and 30 μmol/ L to treat the cell to observe whether curcumin can inhibit AngII-induced over-proliferation and overexpression of CTGF and PAI-1 in cardiac fibroblasts.Conclusion:Curcumin inhibits AngII-induced cardiac fibrosis by suppressing over proliferation and the overexpression of CTGF and PAI-1 in AngII-stimulated cardiac fibroblasts.

Curcumin;Angiotensin II;Cardiac fibroblast;Fibrosis

R543.23

:B

:1006-3250(2015)07-0869-03

2015-04-19

楊蕙宇(1984-)女，講師，醫(yī)學(xué)碩士，從事心血管內(nèi)科疾病的教學(xué)與研究。