針刺對去卵巢骨質疏松模型大鼠骨密度、骨形態計量學的影響*

王亞軍，劉梅潔，鞠大宏，劉 靜，徐亞莉，劉丁龍，高 原

(1.甘肅中醫學院針灸推拿系，蘭州 730000;2.中國中醫科學院中醫基礎理論研究所，北京 100070)

針刺對去卵巢骨質疏松模型大鼠骨密度、骨形態計量學的影響*

王亞軍1，2，劉梅潔2，鞠大宏2，劉 靜1，徐亞莉1，劉丁龍1，高 原1

(1.甘肅中醫學院針灸推拿系，蘭州 730000;2.中國中醫科學院中醫基礎理論研究所，北京 100070)

目的:觀察針刺對去卵巢骨質疏松模型大鼠骨密度、骨計量的影響。方法:雌性SD大鼠50只按隨機數字表法分成空白對照組、假手術組(sham)、模型組(OVX)、己烯雌酚組、電針組各10只。行雙側卵巢切除術復制骨質疏松模型，造模飼養13周后開始治療。分別給予己烯雌酚灌胃，針刺穴取“三陰交”、“足三里”、“腎俞”、“脾俞”，連接電針每次15 min，所有治療均連續5 d，休息2 d，共治療13周。治療結束后，測量全身骨密度(BMD)，處死大鼠取左側脛骨近端1/3，制作不脫鈣骨切片，觀察骨小梁體積百分比(TBV%)、骨小梁吸收表面百分比(TRS%)、骨小梁形成表面百分比(TFS%)、類骨質平均寬度(OSW)、骨小梁礦化率(MAR)、骨皮質礦化率(mAR)。結果:與假手術組比較，模型組大鼠BMD顯著降低，脛骨TBV%顯著降低，TRS%、TFS%、OSW、MAR和mAR均顯著升高;與模型組比較電針組大鼠BMD明顯增高，脛骨TBV%明顯增高，TRS%、TFS%、OSW、MAR和mAR均明顯降低。結論:針刺可以提高去卵巢后大鼠的骨密度和大鼠脛骨TVB%，同時降低大鼠脛骨TRS%、TFS%、OSW、MAR和mAR，提示針刺治療骨質疏松主要是通過對骨吸收的影響發揮作用。

骨質疏松癥;針刺;骨密度;骨計量

隨著人均壽命的不斷延長，骨質疏松癥發病率呈逐年上升趨勢，估計到2050年由于骨質疏松癥而導致的骨折將會增加到6.3億［1］。婦女由于生理原因，大約1/5的絕經后婦女將會罹患與骨質疏松有關的骨折［2］，尤其是脊柱和髖骨骨折往往伴隨很高的并發癥和死亡率［3］。骨質疏松癥的治療，目前國內外主要應用藥物療法，但其臨床療效卻是有限的，且這些藥物存在著副作用大、長期耐受性差、價格昂貴等缺點。雖然國內應用針刺治療骨質疏松癥在臨床和實驗研究中取得了一定進展，但其療效評價、治療機制仍存在許多未解決的問題［4-5］。本實驗觀察針刺對去卵巢骨質疏松模型大鼠骨密度、骨計量的影響，以期為臨床應用提供科學實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物分組

SPF級雌性SD大鼠50只，體質量200～220 g，由甘肅中醫學院科研動物實驗中心提供(許可證編號SCXK(甘)2011-0001)。按隨機數字表法分為空白對照組、假手術組(sham)、模型組(OVX)、己烯雌酚組、電針組各10只。

1.2 主要試劑和儀器

己烯雌酚:合肥久聯制藥有限公司生產(批號20100108)，給藥劑量0.045 mg/kg體質量;水合氯醛:天津市光復精細化工研究所(批號20130305);鹽酸四環素:美國 Amresco公司生產(批號20120301);冷凍切片機:英國TBS公司;Prodigy-BX IL型骨密度儀測量儀 (雙能X線):美國 Lunar公司;針灸針:蘇州針灸器械廠，1寸 0.35×13 mm; G6805-Ⅱ型電針:鑫升有限責任公司;Leica-Qwin圖像分析儀系統:德國Leica公司。

1.3 方法

1.3.1 模型制作 適用性飼養1周，參照文獻方法［6］行雙側摘除卵巢形成骨質疏松模型:將大鼠以10%水合氯醛(3 ml/kg體質量)腹腔注射麻醉，腹位固定。在其最末肋骨下，腋中線與距脊柱外側約1 cm之交叉處剪去鼠毛。以70%的酒精以及碘酊消毒，切開皮膚、背部肌肉和腹膜，以小鑷子輕輕將白色發亮脂肪團拉出切口外，分離脂肪團便可見到卵巢。先將卵巢下端輸卵管用絲線結扎，然后摘除卵巢。切口縫合后，外部敷以消炎粉，同法摘除另一側卵巢。假手術組只暴露雙側卵巢但不切除。

1.3.2 治療 造模飼養13周后，開始治療。電針治療組穴取“三陰交”、“腎俞”、“脾俞”、“足三里“，定位參照《實驗針灸學》［7］類比取穴。針具及穴位常規消毒后，用30號0.5寸不銹鋼毫針快速刺入皮下相應深度后，分別接G6805-Ⅱ型電針儀，波形疏密波頻率10 Hz，以大鼠肢體抽動為度，雙側電針15 min。每周連續治療5次，休息2次，每次15 min，共治療13周。

己烯雌酚治療組根據文獻計算給藥劑量［8］，灌胃給予藥液濃度為0.0045 mg/ml的己烯雌酚，按照體質量1 ml/100 g計算。連續5 d，休息2 d，治療13周。模型組(OVX)、假手術組(sham)除抓取刺激外，不給予任何處理。

1.3.3 檢測指標 治療結束后，分別做以下測量:①骨密度:于最后1次針刺后，用10%水合氯醛(3ml/kg)對實驗大鼠作腹腔注射麻醉，俯臥位置，采用 Prodigy-BX IL型骨密度測量儀 (美國LUNAR)，通過計算機系統中小動物軟件測定大鼠全身骨密度，由計算機控制程序自動分析并顯示結果;②骨形態計量學指標測量:處死前16 d和前3 d分別腹腔注射鹽酸四環素30 mg/kg體質量，以對骨進行熒光標記。將各組大鼠處死，取左側脛骨近端1/3去除軟組織，參照文獻方法［9-10］制作不脫鈣骨切片，進行骨組織形態計量學指標的檢測。采用LeicaQwin圖像分析系統對TBV%、TRS%、TFS%、OSW、MAR、Mar進行計量分析。

1.3.4 統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件進行統計分析，實驗結果以均數±標準差(±s)表示，正態分布且方差齊性數據采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗，方差不齊時采用其項下的Dunnett’s T3檢驗，非正態分布數據采用非參數檢驗。

2 結果

2.1 針刺對絕經后骨質疏松癥模型大鼠骨密度的影響

表1顯示，與假手術組比較，模型組大鼠BMD顯著降低(P＜0.01)。與模型組比較，己烯雌酚組大鼠BMD顯著增高(P＜0.01)，電針組大鼠BMD明顯增高(P＜0.05);電針組、己烯雌酚組BMD仍顯著低于假手術組(P＜0.01，P＜0.01)，提示電針干預13周后可以使大鼠BMD升高，但未恢復到正常水平。

表1 各組大鼠骨密度變化比較

2.2 針刺對絕經后骨質疏松癥模型大鼠骨形態計量學的影響

2.2.1 針刺對絕經后骨質疏松癥模型大鼠脛骨TBV%的影響 表2顯示，與假手術組比較，模型組大鼠脛骨TBV%顯著降低(P＜0.01);與模型組比較，電針組大鼠脛骨TBV%明顯增高(P＜0.05);己烯雌酚組大鼠脛骨TBV%顯著增高(P＜0.01);己烯雌酚組、電針組大鼠脛骨TBV%仍顯著低于假手術組(P＜0.01，P＜0.01)，提示針刺干預后13周后大鼠脛骨TBV%未恢復到正常水平。

表2 各組大鼠脛骨TBV%變化比較

2.2.2 針刺對絕經后骨質疏松癥模型大鼠脛骨TRS%和TFS%的影響 表3顯示，與假手術組比較，模型組TRS%、TFS%顯著升高(P＜0.01，P＜0.01)。與模型組比較，己烯雌酚組大鼠脛骨TRS%、TFS%顯著降低(P＜0.01，P＜0.01);電針組大鼠脛骨TRS%、TFS%明顯降低(P＜0.05，P＜0.05)。與假手術組比較，己烯雌酚組大鼠脛骨的TRS%、TFS%差異有統計學意義(P＜0.01，P＜0.01)，電針組大鼠脛骨的TRS%、TFS%差異有統計學意義(P＜0.05，P＜0.05)，表明己烯雌酚、針刺治療13周后大鼠脛骨TRS%、TFS%恢復都未達到正常水平。

表3 各組大鼠脛骨TRS%、TFS%的變化

2.2.3 針刺對絕經后骨質疏松癥模型大鼠脛骨OSW、MAR和MAR的影響 表4顯示，與假手術組比較，模型組大鼠脛骨OSW、MAR和mAR均顯著升高(P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01)。與模型組比較，己烯雌酚組大鼠脛骨OSW、MAR和mAR均顯著降低(P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01);電針組大鼠脛骨OSW、MAR和mAR均明顯降低(P＜0.05，P＜0.05，P＜0.05);與假手術組比較，電針組脛骨的MAR差異有統計學意義，表明MAR的恢復尚未達到正常水平。

表4 各組大鼠脛骨OSW、MAR和mAR的變化

3 討論

骨質疏松癥是一種常見的骨骼疾病，多伴隨骨骼強度下降，骨折的高風險往往引起一系列嚴重臨床后果。中醫文獻尚無OP病名，但從其發病部位及臨床癥狀來看，屬于中醫學“骨痹”、“骨痿”范疇。絕經后婦女骨質疏松癥乃本虛標實、虛實相兼之癥，肝脾腎痿虛、骨枯髓痿為本、邪阻經絡為標;在此基礎上形成血瘀，痹阻經絡又進一步促進骨質疏松癥的發展［11］。因此治療應首先改善腎虛同時兼顧脾肝，輔以通絡為要義。

針刺治療骨質疏松癥常選取足太陽膀胱經、督脈、足陽明胃經、足太陰脾經、足少陰腎經、足少陽膽經、任脈等經穴［12］。有文獻統計，治療絕經后骨質疏松癥所取經穴的頻率發現，所選穴位以腎經、脾經穴位為多，其中以腎俞、脾俞、足三里三穴使用頻率為最高［13］。結合臨床研究工作我們制定了針刺處方，取三陰交、腎俞、足三里、脾俞組成針刺治療配穴方案。

本實驗結果顯示，造模6個月后模型組(OVX)全身骨密度與假手術組比較顯著下降，這表明摘除卵巢復制骨質疏松病理模型是成功的。經過13周的干預，結果顯示己烯雌酚組、針刺組比模型組(OVX)大鼠骨密度明顯增高。其中服用己烯雌酚組效果最佳，說明該模型的確造成了雌激素下降，故對應用己烯雌酚治療反應性最好，表明本實驗模型形成骨質疏松模型是由于雌激素的下降導致的。從結果可以看出，針刺組骨密度明顯升高，這表明給予針刺治療對改善機體骨質疏松的骨骼密度丟失有著積極意義。本研究從實驗的角度驗證了針刺對BMD的療效。

結合其他［14-18］采用同樣雙側去卵巢模型的相關研究，多觀察的是針刺干預8周、12周后BMD的變化，都顯示針刺可以改善去卵巢導致的BMD下降，其結論與我們的研究結論一致。但這些研究大多數采用的測量部位是脛骨股骨或腰椎的骨密度，很少采用全身骨密度作為骨密度變化的效應指標，全身骨密度是綜合全身肢體的骨骼總體密度平均值，因此應用該指標反應骨質變化更為全面。

與骨密度比較，骨組織形態學更具特異性，骨礦物與骨組織形態學測量有效結合可全面反映骨生理、病理與功能變化，從而對骨質量和骨強度作出科學判斷。因此，對骨質疏松的治療不僅要考慮骨量的增加，更需要考慮改善骨質結構，如骨小梁的修復、重建，這一過程需要成骨細胞和破骨細胞的協同作用。本研究采用骨組織形態學方法，對脛骨的骨形態計量學指標進行了觀察，以求更全面地反映針刺的治療效果。

作為衡量骨量水平的主要標志，TBV%指的是骨小梁體積占被測骨髓腔總體積的百分比，TRS%是指不規則、凹凸不平的骨小梁表面占骨小梁表面的百分比，TFS%是指有成骨細胞被覆的類骨質表面占骨小梁表面的百分比，它們可以分別判斷破骨細胞和成骨細胞的活性;在一定程度上，MAR、OSW和mAR也能反映成骨細胞的活動狀況，因此它們常與TFS%一起反映骨形成的情況［19］。

本實驗結果顯示，模型組(OVX)大鼠脛骨TBV%(代表骨量)顯著低于假手術組，結合此模型大鼠BMD存在下降的變化，因此本研究模型造成大鼠骨量顯著減少，模型復制成功。

同時，本研究還觀察到該模型TRS%(代表骨吸收)以及代表TFS%、OSW、MAR和Mar(代表骨形成)均顯著增高，進一步說明通過雙側卵巢切除形成的是高轉換的骨質疏松癥模型:骨量顯著降低，成骨細胞和破骨細胞活性均顯著增強，骨形成與骨吸收均增高(均活躍)，但骨吸收大于骨形成，該模型完全符合絕經期婦女骨質疏松的病理機制。

實驗研究結果顯示，與模型組比較，經過13周治療后針刺組大鼠脛骨TBV%明顯增高，而TRS%、TFS%、OSW、MAR和mAR均顯著降低。與假手術組比較，盡管針刺組大鼠脛骨OSW、mAR沒有明顯差異，但大鼠脛骨TRS%、TFS%、MAR還未完全恢復正常。這一結果說明，針刺對雙側卵巢切除骨質疏松具有治療作用，是通過增加骨量，降低骨轉換率，降低破骨細胞的活性，最終達到對骨質疏松癥骨代謝的影響而體現其治療效應。

其次，本研究針灸處方的意義在于，三陰交可調節肝、脾、腎功能，為肝、脾、腎經的交會穴，可補益三臟之虛;“腎主骨”，腎氣虛衰是OP的根本病理基礎，取腎俞可補腎氣，糾正腎虛引起的OP病癥，兩穴相配可補益肝腎、固護先天，改善女子肝氣郁結、肝陰不足的病理狀況;同時針灸處方中配以足三里、脾俞，足三里為足陽明胃經合穴，胃腑下合穴，配以脾之脾俞，可補益脾胃、強壯機體、培補后天;本處方所用四穴相配，是通過對骨質疏松癥肝、脾、腎虛虧虛病理狀態的調整，改善OP病機，從而達到改善骨骼功能的治療目的。整個治療方案較好地契合了中醫的病因病機，實驗結果提示該腧穴配伍對臨床具有較好的參考價值。

由于條件所限，我們只做了13周的針刺干預，結果顯示針刺對骨密度的改善還未達到正常水平，我們考慮這可能是由于骨質疏松癥是一個長期形成的過程，治療也需要漫長的過程。因此，今后的研究可考慮采取更長時間的治療周期，可以更好地凸顯針刺的治療效果，為臨床應用提供有價值的參考依據。考慮到針刺治療效果的整體性、多層次、多靶點的調節作用特點，療效的評估除了骨密度外，還應該對針刺治療所可能產生的全身整體調節作用給予深入探究。

［1］文天林，孫天勝，王玲.骨質疏松癥的流行病學、病因和分類［J］.人民軍醫，2010(9):662-663.

［2］Kanis JA，Johnell O，Oden A，et al.Long-term risk of osteoporotic fracture in Malm［J］.Osteoporos Int，2000，11 (8):669-674.

［3］Klibanski A， Adams-Campbell L， Bassford T， et al.Osteoporosis prevention，diagnosis，and therapy.JAMA，2001，285(6):785–795.

［4］王亞軍，鞠大宏.針灸治療婦女絕經后骨質疏松的實驗研究進展述評［J］.按摩與康復醫學，2012，3(3):57-59.

［5］徐亞莉，金建軍，徐登玉.針灸治療骨質疏松癥研究進展［J］.甘肅中醫學院學報，2006，23(2):53-56.

［6］鞠大宏，于福祿，張麗坤，等.滋陰補腎法對卵巢切除所致骨質疏松大鼠成骨細胞COX-2蛋白和mRNA表達的影響［J］.中國中醫基礎醫學雜志，2006，12(12):918-920.

［7］郭義.實驗針灸學［M］.北京:中國中醫藥出版社，2008:1.

［8］徐叔云.藥理實驗方法［M］.3版.北京:人民衛生出版社，2002:1.

［9］劉紹泉.塑料包埋不脫鈣骨組織玻璃刀切片技術［J］.中華病理學雜志，1996(1):49.

［10］章明放，張乃鑫，譚郁彬.運動對雌性大鼠去勢后骨質疏松癥的作用［J］.中華骨科雜志，1994，14(6):365-369.

［11］楊路昕，蔡輝.原發性骨質疏松癥的中醫病因病機研究進展［J］.河北中醫，2009，31(3):467-469.

［12］劉儒鵬，榮培晶，Gary Guishan Xiao.針刺治療原發性骨質疏松癥的研究概況與述評［J］.中國中醫基礎醫學雜志，2011，17(12):1400-1401.

［13］徐敏，劉保新，黃承軍，等.原絕經后骨質疏松癥的穴位治療進展［J］.浙江中醫藥大學學報，2011，35(2):301-302.

［14］杜革術.針刺對絕經后骨質疏松患者骨密度及血清雌二醇的影響［J］.上海針灸雜志，2011，30(2):104-106.

［15］王華，鮑圣涌，周曉莉，等.“雙固一通”針法對絕經后骨質疏松癥模型大鼠骨礦物質含量、骨密度和雌二醇的影響［J］.上海針灸雜志，2005，24(10):39-41.

［16］魏玉芳，劉鈺林，張姍紅，等.針刺對去勢大鼠骨質疏松模型雌激素及骨密度作用的研究［J］.針刺研究，2007，32(1):38-41.

［17］歐陽鋼，唐曦，莫非，等.針刺干預對去卵巢大鼠模型骨密度和鈣調節激素的影響［J］.中華中醫藥雜志，2013，28(4):1130.

［18］Zhou J，Chen S，Guo H，et al.Electroacupuncture prevents ovariectomy-induced osteoporosis in rats:a randomised controlled trial［J］.Acupunct Med，2012，30(1):37-43.

［19］崔燎，吳鐵.骨質疏松藥理學動物實驗與圖譜［M］.北京:科學技術出版社，2011:1.

R245.31

:B

:1006-3250(2015)07-0857-03

2015-01-19

國家自然科學基金地區基金項目(81260584)-從破骨細胞分化調節通路OPG-RANKL-RANK探討針刺治療骨質疏松癥的作用機理;中國博士后科學基金項目(2012M510725)-基于OPGRANK-RANKL系統探討針刺治療骨質疏松癥機制

王亞軍(1970-)，男，陜西人，副教授，醫學博士后，從事針灸治療骨質疏松癥的臨床療效評價與機理研究。