鹿茸中藥復方對去卵巢骨質疏松癥大鼠腎組織Msx2 mRNA及蛋白表達的影響*

王 劍，鄭洪新，張錦萍，劉 研，劉劍輝，宋光熠，劉瑞輝

(1.遼寧醫藥職業學院，沈陽 110101;2.遼寧省基礎醫學研究所，沈陽 110101; 3.遼寧中醫藥大學基礎醫學院，沈陽 110847)

鹿茸中藥復方對去卵巢骨質疏松癥大鼠腎組織Msx2 mRNA及蛋白表達的影響*

王 劍1，2，鄭洪新3△，張錦萍1，劉 研1，劉劍輝1，宋光熠1，劉瑞輝1

(1.遼寧醫藥職業學院，沈陽 110101;2.遼寧省基礎醫學研究所，沈陽 110101; 3.遼寧中醫藥大學基礎醫學院，沈陽 110847)

目的:觀察去卵巢骨質疏松癥大鼠腎組織 Msx2 mRNA及蛋白表達，探討絕經后骨質疏松癥(Postmenopausal Osteoporosis，PMOP)的發病機制以及鹿茸中藥復方的療效機理。方法:去卵巢復制骨質疏松癥大鼠模型，實驗設正常組、模型組、假手術組、鹿茸中藥復方組、鈣爾奇D組、骨疏康組，灌胃給藥12周。應用雙能X線骨密度儀檢測骨密度，實時定量RT-PCR及Western Blot檢測Msx2 mRNA及蛋白表達。結果:與正常組比較，模型組股骨骨密度明顯降低、腎組織Msx2 mRNA及蛋白表達明顯降低;與模型組比較，鹿茸中藥復方組、骨疏康組股骨骨密度明顯升高;鹿茸中藥復方組、鈣爾奇D組、骨疏康組腎組織Msx2 mRNA表達明顯上調;鹿茸中藥復方組腎組織Msx2蛋白表達明顯上調;與鈣爾奇D組、骨疏康組比較，鹿茸中藥復方組腎組織Msx2 mRNA及蛋白表達均明顯升高。結論:PMOP的發病機制之一可能是腎組織Msx2 mRNA及蛋白表達降低，鹿茸中藥復方可能通過上調腎組織Msx2 mRNA及蛋白表達，有效防治PMOP，其作用優于鈣爾奇D和骨疏康。

絕經后骨質疏松癥;鹿茸中藥復方;Msx2

絕經后骨質疏松癥 (Postmenopausal Osteoporosis，PMOP)是原發性骨質疏松癥之一，嚴重危害老年人的健康，隨著社會老齡化的增速，PMOP患病人群日益龐大。調查表明，目前約占我國人口7%的骨質疏松癥患者中半數為50歲以上的婦女［1］，故深入探討PMOP的發病機制和防治方法具有重要的現實意義。本研究依據中醫“腎主骨”理論研制具有補腎填精、益髓壯骨功效的鹿茸中藥復方，通過觀察腎組織Msx2(muscle segment homeobox gene 2)mRNA及蛋白表達變化，探討鹿茸中藥復方對去卵巢骨質疏松癥大鼠的療效與機理，為中醫藥防治PMOP提供實驗依據。

1 材料

1.1 動物

SPF級Wistar雌性大鼠100只，4～5月齡，體質量(275±25)g，購自遼寧長生生物技術有限公司(合格證號0004179)。

1.2 藥品

鹿茸中藥復方由鹿茸、淫羊藿、牡蠣組成，對照藥鈣爾奇D(Wyeth)、骨疏康顆粒(遼寧康辰藥業有限公司)。

1.3 主要儀器

XR-36型雙能X線骨密度儀(NORLAND)、ABI 7500型定量 PCR儀、PowerPac200電泳儀(BIORAD)等。

TRIZOL(康為世紀)、實時定量RT-PCR試劑盒(TaKaRa)、羊抗Msx2多克隆抗體(santa cruz)、堿性磷酸酶標記的兔抗羊IgG(北京中山生物公司)等。

2 方法

2.1 分組

預實驗用7只，余者按隨機數字表法分為6組，正常組(A)12只，模型組(B)12只，假手術組(C)12只，鹿茸中藥復方組(D)20只，鈣爾奇D組(E)18只，骨疏康組(F)19只。

2.2 造模

正常組除外其余麻醉，2%戊巴比妥鈉腹腔注射(35 mg/kg)，然后腹部切口行雙側卵巢摘除術，其中假手術組只切切口不摘除卵巢。

2.3 給藥

術后7 d開始每日灌胃1次，連續12周。大鼠給藥劑量按成人劑量的6.3倍計算，給藥容積0.5 ml/100 g。A、B、C 3組均給予生理鹽水，D組給予鹿茸中藥復方1.139 g·kg-1·d-1，E組給予鈣爾奇D 0.126 g鈣·kg-1·d-1，F組給予骨疏康顆粒2.1 g ·kg-1·d-1。

答：勇敢些！不要讓自己被國際趨勢和要求控制．明確自己的研究問題，并深入思考進行研究．當然，對于年輕研究者而言，了解和借鑒一些國際已有的數學教育研究是必要的．但是回顧我們領域內目前發表的研究中高質量的、影響深遠的文章，無一不是得益于研究者“勇敢”的探究．

2.4 指標檢測

2.4.1 骨密度(BMD) 取右后肢全股骨剔除附著筋肉，生理鹽水潤濕醫用紗布后包裹骨外，紗布外裹錫紙，-20℃冰箱凍存待測。應用XR-36型雙能X線骨密度儀對大鼠離體股骨骨密度進行檢測，應用儀器附帶軟件進行數據分析。

2.4.2 Msx2 mRNA表達 取左腎皮髓交界處一塊約100 mg的腎組織，放入預裝1ml Trizol的EP管內，-70℃冰箱凍存待測。按Trizol試劑盒說明書抽提樣品總RNA。測抽提物260 nm與280 nm的吸光度，OD 260/OD 280約2.0，提示為RNA純品。應用ABI 7500型定量PCR儀進行反轉錄和實時定量PCR擴增，引物由北京華大基因公司合成。Msx2上游引物:5'-GGG CAC AGA GGA GAT TG-3'，下游引物:5'-GGG AAG AGG TGG ACA GG-3'，擴增產物長度294 bp。由儀器自帶軟件收集擴增數據并計算Ct值，以GAPDH(上游引物:5'-CGT ATC GGA CGC CTG GTT-3'，下游引物:5'-CGT GGG TAG AGT CAT ACT GGA AC-3'，擴增產物長度124 bp)為內參校準，采用2-△△Ct(Livak)方法對Msx2的mRNA表達進行相對定量。

2.4.3 Msx2蛋白表達 取左腎皮髓交界處一塊約100 mg的腎組織放入空白EP管內，-70℃冰箱凍存，待做Western Blot。細胞裂解法提取樣品總蛋白，Lowry法定量，SDS-PAGE凝膠電泳、轉印，羊抗Msx2多克隆抗體、堿性磷酸酶標記的兔抗羊IgG孵育，酶顯法顯色。Tanon-2500R型全自動數碼凝膠成像系統成像，使用Scion Image軟件分析灰度值。以GAPDH為內參校準，以Msx2條帶灰度值/ GAPDH條帶灰度值來表示其相對蛋白表達。

2.5 統計學方法

采用SPSS 15.0統計軟件進行統計分析，單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

大鼠在灌胃期間死亡5只，取材時共88只。

3.1 骨密度

表1顯示，與正常組比較，模型組明顯降低(P＜0.001);與模型組比較，鹿茸中藥復方組、骨疏康組明顯升高(P＜0.05)，鈣爾奇D組雖有升高趨勢，但無統計學意義(P＞0.05)。

表1 各組大鼠離體股骨骨密度比較(±s)

表1 各組大鼠離體股骨骨密度比較(±s)

注:與正常組比較:＊＊＊P＜0.001;與模型組比較:△P＜0.05

組別 例數 股骨骨密度(g/cm2) 12 0.1375±0.0063模 型 組 12 0.1259±0.0060＊＊＊假 手 術 組 11 0.1331±0.0109△鹿 茸 中 藥 復 方 組 19 0.1327±0.0095△鈣 爾 奇 D 組 17 0.1286±0.0058骨 疏 康 組 17 0.1321±0.0057正常組△

3.2 Msx2 mRNA表達

表2顯示，與正常組比較，模型組明顯降低(P＜0.001);與模型組比較，鹿茸中藥復方組(P＜0.001)、鈣爾奇 D組(P＜0.01)、骨疏康組(P＜0.01)明顯上調;與鈣爾奇D組、骨疏康組比較，鹿茸中藥復方組明顯升高(P＜0.01)。

3.3 Msx2蛋白表達

圖1表3顯示，與正常組比較，模型組明顯降低(P＜0.001);與模型組比較，鹿茸中藥復方組明顯上調(P＜0.01)，鈣爾奇D組、骨疏康組雖有升高趨勢，但無統計學意義(P＞0.05);與鈣爾奇D組、骨疏康組比較，鹿茸中藥復方組明顯升高(P＜0.05)。

表2 各組大鼠腎組織Msx2 mRNA表達(±s)

表2 各組大鼠腎組織Msx2 mRNA表達(±s)

注:與正常組比較:＊＊＊P＜0.001;與模型組比較:△△P＜0.01，△△△P＜0.001;與鈣爾奇D組比較:★★P＜0.01;與骨疏康組比較:※※P＜0.01

組別 例數 Msx2(mRNA) 10 1.001±0.067模 型 組 10 0.326±0.043＊＊＊假 手 術 組 10 0.927±0.077△△△鹿 茸 中 藥 復 方 組 10 0.776±0.035△△△★★※※鈣 爾 奇 D 組 10 0.587±0.075△△骨 疏 康 組 10 0.538±0.120正常組△△

圖1 腎組織Msx2、GAPDH蛋白Western Blot條帶

4 討論

PMOP指主要由絕經后雌激素水平降低引起的骨質疏松癥。我國PMOP患病人數據調查不少于2000萬，患病人群日益龐大，深入探討其發病機制和防治方法具有重要的現實意義。

表3 各組大鼠腎組織Msx2蛋白表達(±s)

表3 各組大鼠腎組織Msx2蛋白表達(±s)

注:與正常組比較:＊＊＊P＜0.001;與模型組比較:△△P＜0.01，△△△P＜0.001;與鈣爾奇D組比較:★P＜0.05;與骨疏康組比較:※P＜0.05

組別 例數 Msx2(蛋白) 10 0.780±0.115模型正常組10 0.435±0.048組 10 0.416±0.059＊＊＊假 手 術 組 10 0.814±0.134△△△鹿 茸 中 藥 復 方 組 10 0.584±0.070△△★※鈣 爾 奇 D 組 10 0.468±0.064骨 疏 康 組

中醫學古籍中雖沒有“骨質疏松癥”這一病名的記載，但有關“骨痹”(骨重不可舉、骨髓酸痛)、“骨痿”(腰脊不舉)、“骨縮病”(諸骨皆枯，漸至短縮)等描述均與骨質疏松癥的癥狀(骨痛、腰背痛最多見，駝背、變矮、骨折)比較相似，因此探討骨質疏松癥的中醫病因病機可參照中醫古籍對相關骨病的認識。《素問·痿論》:“腎氣熱，則腰脊不舉，骨枯而髓減，發為骨痿。”《扁鵲心書·骨縮》:“此由腎氣虛憊，腎主骨，腎水既涸，則諸骨皆枯，漸至短縮。”中醫理論認為“腎藏精生髓主骨”，骨病多責之于腎。《素問·六節藏象論》:“腎者、主蟄，封藏之本，精之處也……其充在骨。”《素問·痿論》:“腎主身之骨髓。”《素問·脈要精微論》:“骨者髓之府”，都說明腎主藏精，精生髓，髓居于骨中，骨賴髓以充養。《靈樞·本神》:“精傷則骨酸痿厥”，說明腎精虧虛，生髓不足，無以養骨而發生骨質疏松等病變。《素問·上古天真論》:“女子七歲，腎氣盛，齒更發長……四七筋骨堅……七七……天癸竭，地道不通，故形壞而無子也”，說明女子盛年之前，腎中精氣與齡俱充，生髓充盛，滋養骨骼，骨堅有力;盛年之后，腎中精氣與齡俱衰，七七絕經后，精虧生髓不足，骨骼失于滋養而痿軟無力即發骨質疏松。因此，PMOP的病機是腎虛精虧、髓減骨枯，防治該病可選用補腎填精、益髓壯骨法。

現代醫學研究表明，腎小管對Ca2+的重吸收可以調節血鈣水平，進而調節甲狀旁腺激素分泌，影響破骨細胞分化及其骨吸收活性，間接調節骨吸收［2，11］。瞬時性受體電位通道5(transient receptor potential vanilloid 5，TRPV5)是介導腎小管主動重吸收Ca2+的主要蛋白，其表達下降或失活可能導致尿鈣顯著增多［3］。Msx基因家族的Msx2可通過對其下游一系列基因表達的級聯調控作用激活TRPV5。Msx2抑制 Runx2轉錄［4］，Runx2上調 Osterix轉錄［5-6］，Osterix阻止PPARγ基因表達［7］，PPARγ上調血清糖皮質激素誘導蛋白激酶1的mRNA表達［8-9］;血清糖皮質激素誘導蛋白激酶 1激活TRPV5［8-10］，從而使腎小管對Ca2+的重吸收增加，血鈣濃度升高，從而使甲狀旁腺主細胞的活動降低，甲狀旁腺激素的分泌下降，受其誘導的破骨細胞分化減少，受其促進的破骨細胞骨吸收活性減弱，從而減少骨吸收［11］。

Msx2在PMOP的發病機制及其中醫藥治療方面的研究，筆者尚未查閱到相關文獻。雌性大鼠行雙側卵巢摘除術造模是研究PMOP的經典模型［12］。本研究即采用此法建立PMOP動物模型，以腎組織Msx2 mRNA及蛋白表達作為效應指標，研制具有補腎填精、益髓壯骨功效的鹿茸中藥復方。君藥鹿茸性溫、味甘、咸，歸腎、肝經，有壯腎陽、益精血、強筋骨等功效。現代研究表明，鹿茸含有多種生長因子，可刺激成骨細胞分化、增殖，促進骨的生長、修復，防治骨質疏松;臣藥淫羊藿性溫、味辛、甘，歸腎、肝經，有補腎壯陽、強筋健骨等功效。現代研究表明，淫羊藿的有效藥理成分淫羊藿苷能促進人骨髓間充質干細胞增殖，促進其成骨分化，促進成骨細胞增殖與分化，促進骨形成，抑制破骨細胞分化和功能，抑制骨吸收，防治骨質疏松;佐藥牡蠣性微寒、味咸，歸腎、肝經，具有補腎壯骨、滋陰潛陽的功效。現代研究表明，牡蠣中含90%以上的碳酸鈣，補鈣效果好，可防治骨質疏松。作為實驗因素，選用西醫臨床治療骨質疏松癥的常用藥鈣爾奇D(藥理作用是促進腸道吸收鈣、磷和骨骼正常鈣化)和中藥復方治療骨質疏松癥的骨疏康顆粒(具有補腎益氣、活血壯骨的功效)為對照藥，探討PMOP的發病機制以及鹿茸中藥復方的療效機理。結果顯示，模型組骨密度比正常組明顯降低，說明本研究成功復制了PMOP動物模型。模型組腎組織Msx2 mRNA及蛋白表達比正常組明顯降低，可能通過影響其下游一系列基因表達而增強骨吸收。與模型組比較，鹿茸中藥復方明顯上調腎組織Msx2 mRNA及蛋白表達，可能通過級聯調控其下游一系列基因的表達而減少骨吸收，從而使骨密度明顯升高，療效顯著，勝于骨疏康顆粒;鈣爾奇 D雖亦可明顯上調腎組織 Msx2的mRNA表達，但對其蛋白表達和骨密度的升高均無統計學意義。因此，絕經后骨質疏松癥的發病機制之一可能是腎組織Msx2 mRNA及蛋白表達降低;具有補腎填精、益髓壯骨功效的鹿茸中藥復方可明顯上調腎組織Msx2 mRNA及蛋白表達，有效防治絕經后骨質疏松癥，療效勝于鈣爾奇D及骨疏康顆粒，臨床可選用補腎填精、益髓壯骨法防治絕經后骨質疏松癥。

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Effects of Antler Prescription on the Expression of Msx2 mRNA and Protein in Renal Tissue of Ovariectomy Osteoporosis rats

WANG Jian1，2，ZHENG Hong-xin3△，ZHANG Jin-ping1，LIU Yan1，LIU Jian-hui1，SONG Guang-yi1，LIU Rui-hui1
(1.Liaoning Vocational College of Medicine，Shenyang 110101，China;2.Liaoning Institute of Basic Medicine，Shenyang 110101，China;3.Basic Medical College，Liaoning University of TCM，Shenyang 110847，China)

Objective:To discuss the pathogenesis of postmenopausal osteoporosis(PMOP)and the therapeutic effect and mechanism of pilose antler traditional Chinese medicine compound by Msx2 mRNA and protein expression in kidney tissues of ovariectomized osteoporosis rats.Methods:We established the osteoporosis rat models by ovariotomy.We divided all the rats into normal group，model group，sham-operated group，pilose antler traditional Chinese medicine compound group，GAIERQI D group and GUSHUKANG group.After 12 weeks of administrating by gavage，we used dual energy X-ray absorptiometry to detect bone mineral density，Real-Time Quantitative RT-PCR to detect Msx2 mRNA expression and Western Blot to detect Msx2 protein expression.Results:Compared with normal group，femur bone mineral density of model group decreased significantly，Msx2 mRNA and protein expression decreased significantly in kidney tissues.Compared with model group，femur bone mineral density of pilose antler traditional Chinese medicine compound group and GUSHUKANG group increased significantly;Msx2 mRNA expression in kidney tissues of pilose antler traditional Chinese medicine compound group，GAIERQI D group and GUSHUKANG group up-regulated significantly;Msx2 protein expression in kidney tissues of pilose antler traditional Chinese medicine compound group up-regulated significantly.Compared with GAIERQI D group and GUSHUKANG group，Msx2 mRNA and protein expression in kidney tissues of pilose antler traditional Chinese medicine compound group both increased significantly.Conclusions:Maybe it is one aspect of the pathogenesis of PMOP that Msx2 mRNA and protein expression in kidney tissues decreases;Pilose antler traditional Chinese medicine compound has better effects of up-regulating Msx2 mRNA and protein expression in kidney tissues to prevent and treat PMOP than GAIERQI D and GUSHUKANG.

postmenopausal osteoporosis(PMOP);pilose antler traditional Chinese medicine compound;muscle segment homeobox gene 2(Msx2)

R285.5

:B

:1006-3250(2015)07-0800-03

2015-04-16

遼寧省教育廳科學研究一般項目 (L2011247)-補腎益髓法對絕經后骨質疏松癥Runx2相關基因表達的級聯調控作用

王 劍(1978-)，女，遼寧沈陽人，副教授，醫學博士，從事中醫藥與分子生物學相關研究。

△通訊作者:鄭洪新，教授，博士研究生導師，從事中醫病因病機理論研究，E-mail:zhenghx2002@126.com。