益氣活血法對(duì)缺氧損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用的研究*

陳 冰，李玉梅，張立石，薛 欣，馬雅鑾

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700)

【實(shí)驗(yàn)研究】

益氣活血法對(duì)缺氧損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用的研究*

陳 冰，李玉梅，張立石，薛 欣，馬雅鑾△

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700)

目的:觀察以黃芪注射液和鹽酸川芎嗪注射液聯(lián)合用藥為代表的益氣活血法對(duì)缺氧損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。方法:建立人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞缺氧損傷模型，實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組、模型組、黃芪組、川芎嗪組及聯(lián)合用藥組。采用MTT檢測(cè)法、AnnexinV-FITC/PI雙染結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)凋亡檢測(cè)法和ELISA檢測(cè)法，觀察藥物對(duì)HUVEC增殖、凋亡和功能(分泌NO和ET)的影響。結(jié)果:與模型組比較，黃芪組和川芎嗪組及聯(lián)合用藥組均可不同程度地減輕缺氧對(duì)HUVEC的損傷，提高其生存率，降低其凋亡率，促進(jìn)NO的分泌，抑制ET的分泌，兩藥聯(lián)用比單用效果好。結(jié)論:益氣活血法可通過促進(jìn)增殖、抗凋亡及改善細(xì)胞分泌功能，有效減輕缺氧后血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。

益氣活血法;人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞;缺氧損傷;凋亡

冠心病屬于中醫(yī)“心痛”、“胸痹”范疇，病位在心，病機(jī)多為本虛標(biāo)實(shí)，臨床論治多采用益氣活血、行氣化痰、通陽開痹等方法。本研究觀察以黃芪注射液和鹽酸川芎嗪注射液聯(lián)合用藥為代表的益氣活血法對(duì)缺氧損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用，并探討其作用機(jī)理。

1 材料

1.1 藥品與試劑

低糖DMEM、胎牛血清、肝素鈉、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子購(gòu)自瑞士ROCHE公司，MTT購(gòu)自德國(guó)Sigma公司，Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司，一氧化氮(Nitrogen monoxidum，NO)測(cè)定試劑盒、內(nèi)皮素(Endothelin，ET)測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。黃芪注射液購(gòu)自正大青春寶藥業(yè)有限公司(批號(hào)1409021)，鹽酸川芎嗪注射液購(gòu)自哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)有限公司(批號(hào)120201A1)。

1.2 儀器

IX-70倒置顯微鏡:日本Olympus公司，F(xiàn)ACS Callibur流式細(xì)胞儀:美國(guó)BD公司，Multiskan酶標(biāo)儀:美國(guó)Thermo公司，3K15高速低溫離心機(jī):德國(guó)Sigma公司，-80℃低溫冰箱:美國(guó)Thermo公司。

2 方法

2.1 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)

取健康胎兒臍帶以PBS反復(fù)沖洗臍靜脈，注入0.1%Ⅱ型膠原酶，兩端以止血鉗夾住，37℃消化20 min，收集消化液離心。以內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液(低糖DMEM，20%胎牛血清，10 μg/mL內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，10 U/mL肝素鈉)重懸細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶中。待細(xì)胞長(zhǎng)成融合狀態(tài)進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定和免疫組化鑒定(Ⅷ因子相關(guān)抗原抗體陽性，純度大于99%)，第3～5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞分成對(duì)照組、模型組、不同濃度黃芪組、不同濃度川芎嗪組和聯(lián)合用藥組(黃芪注射液+鹽酸川芎嗪注射液)。

2.2 血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧損傷模型的建立［1］

取HUVEC傳代于相應(yīng)的培養(yǎng)器皿中，培養(yǎng)24 h后長(zhǎng)成致密單層，把培養(yǎng)液換成含相應(yīng)濃度藥物的PBS，放置于缺氧罐(溫度37℃，100%氮?dú)?中4 h造成細(xì)胞缺氧損傷模型，再換成含相應(yīng)濃度藥物的普通培養(yǎng)液(低糖DMEM，10%胎牛血清)復(fù)氧培養(yǎng)24 h或者48 h，分別收集細(xì)胞及上清用于指標(biāo)檢測(cè)。

2.3 指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1 黃芪注射液和鹽酸川芎嗪注射液對(duì)正常HUVEC的影響 將細(xì)胞以5000/孔的密度接種于96孔板中，待24 h后加入不同濃度的黃芪注射液和鹽酸川芎嗪注射液，作用48 h后，MTT法檢測(cè)藥物對(duì)HUVEC存活率的影響。

2.3.2 藥物對(duì)缺氧損傷HUVEC存活率的影響 以5000/孔的細(xì)胞密度將HUVEC接種于96孔板中，按照(2.2)方法造模后并給予藥物處理，作用48 h后，MTT法檢測(cè)藥物對(duì)缺氧損傷HUVEC存活率的影響。

2.3.3 藥物對(duì)缺氧損傷HUVEC凋亡的影響

以2×104/孔的細(xì)胞密度將HUVEC接種于6孔板中，按照方法(2.2)造模并給予相應(yīng)藥物處理，作用24 h后，收集細(xì)胞采用Annexin V-FITC/PI結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞早期和晚期的凋亡率。

2.3.4 藥物對(duì)缺氧損傷HUVEC分泌功能的影響 實(shí)驗(yàn)方法同2.3.3，作用24 h后收集細(xì)胞上清，ELISA法檢測(cè)藥物對(duì)NO、ET的影響。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 11.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，α=0.05，數(shù)據(jù)經(jīng)過正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)后，進(jìn)行單因素方差分析和兩兩比較的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

3 結(jié)果

3.1 黃芪注射液對(duì)正常HUVEC存活率影響

表1顯示，400 μg/mL劑量的黃芪注射液對(duì)正常HUVEC增殖的促進(jìn)作用為10.95%，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著;其余劑量均無明顯的促進(jìn)增殖作用，因此選用400 μg/mL劑量用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.2 鹽酸川芎嗪注射液對(duì)正常HUVEC存活率的影響

表2顯示，60 μg/mL及以上劑量的鹽酸川芎嗪注射液對(duì)正常HUVEC的增殖有抑制作用，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著;15 μg/mL和30 μg/mL劑量的鹽酸川芎嗪注射液無明顯的抑制增殖作用，因此選用15 μg/ mL的劑量用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 黃芪注射液對(duì)正常HUVEC存活率的影響(±s)

注:與0劑量組比較:*P＜0.05

劑量(μg/mL) 例數(shù) 存活率(%) 0 100.00 4 6 99.53±4.36 6 40 6 101.24±5.23 400 6 110.95±5.69*1000 6 101.43±5.39 2000 6 99.74±4.77

表2 鹽酸川芎嗪注射液對(duì)正常HUVEC存活率的影響(±s)

表2 鹽酸川芎嗪注射液對(duì)正常HUVEC存活率的影響(±s)

注:與0劑量組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

劑量(μg/mL) 例數(shù) 存活率(%) 100.00 15 6 98.70±2.48 30 6 97.41±2.21 60 6 92.04±1.18*120 6 88.21±5.96*240 6 74.89±5.49 0 6＊＊

3.3 不同藥物對(duì)缺氧損傷HUVEC存活影響

表3顯示，與模型組比較，黃芪組、川芎嗪組及聯(lián)合用藥組均可顯著提高缺氧損傷HUVEC的存活率(P＜0.01);聯(lián)合用藥組作用最強(qiáng)，與黃芪組及川芎嗪組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);黃芪組作用次之，與川芎嗪組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

表3 藥物對(duì)缺氧損傷HUVEC存活的影響(±s)

表3 藥物對(duì)缺氧損傷HUVEC存活的影響(±s)

注:與模型組比較:＊＊P＜0.01;與黃芪組比較:△△P＜0.01;與川芎嗪組比較:☆☆P＜0.01

組別 例數(shù) 存活率(%) 100.00模 型 組 6 18.77±2.30黃 芪 組 6 35.84±2.25＊＊川 芎 嗪 組 6 23.08±1.83＊＊△△聯(lián) 合 用 藥 組 6 48.00±3.94對(duì)照組6＊＊△△☆☆

3.4 不同藥物對(duì)缺氧損傷HUVEC凋亡影響

表4顯示，HUVEC缺氧損傷后，模型組早期和晚期凋亡率分別為21.74%和11.78%，與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與模型組比較，黃芪組可降低HUVEC凋亡率(P＜0.05)，聯(lián)合用藥組可顯著降低HUVEC凋亡率(P＜0.01)。聯(lián)合用藥組作用強(qiáng)于黃芪組，與黃芪組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。川芎嗪組對(duì)凋亡率無明顯作用。

表4 藥物對(duì)缺氧損傷HUVEC凋亡的影響(±s)

表4 藥物對(duì)缺氧損傷HUVEC凋亡的影響(±s)

注:與模型組比較:*P＜0.05;＊＊P＜0.01;與黃芪組比較:△P＜0.05，△△P＜0.01;與川芎嗪組比較:☆P＜0.05，☆☆P＜0.01

組 別例數(shù)早期凋亡率(%)晚期凋亡率(%)總凋亡率(%) 6 2.96±0.67 2.14±0.33 5.10±0.86模 型 組 6 21.74±3.93 11.78±2.90 33.51±3.14黃 芪 組 6 17.24±2.31* 8.63±1.41* 25.87±3.23*川 芎 嗪 組 6 20.32±2.72 10.03±1.84 30.35±3.67△聯(lián)合用藥組 6 12.18±1.24＊＊△△☆☆ 6.42±1.14＊＊△☆☆ 18.60±1.85對(duì)照組＊＊△△☆☆

3.5 不同藥物對(duì)缺氧損傷HUVEC分泌功能的影響

表5顯示，各組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。川芎嗪組及聯(lián)合用藥組均可顯著促進(jìn)HUVEC分泌NO，抑制HUVEC分泌ET，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。黃芪注射液組僅對(duì)NO的分泌有改善(P＜0.05)，川芎嗪組促進(jìn)NO的分泌作用強(qiáng)于黃芪注射液組(P＜0.05);聯(lián)合用藥組對(duì)HUVEC分泌NO和ET功能的改善作用最強(qiáng)，與黃芪組、川芎嗪組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表5 不同藥物對(duì)缺氧損傷HUVEC分泌NO和ET影響(±s)

表5 不同藥物對(duì)缺氧損傷HUVEC分泌NO和ET影響(±s)

注:與模型組比較:*P＜0.05;＊＊P＜0.01;與黃芪組比較:△P＜0.05，△△P＜0.01;與川芎嗪組比較:☆P＜0.05，☆☆P＜0.01

組 別 例數(shù) NO(μmol·mL-1) ET(pg·mL-1) 6 95.02±7.46 38.14±4.40模 型 組 6 27.40±5.77 67.38±6.50黃 芪 組 6 36.87±6.82* 62.49±3.53川芎 嗪 組 6 45.67±5.96＊＊△ 54.60±2.51＊＊△△聯(lián)合用藥組 6 55.81±7.47＊＊△△☆ 48.70±3.51對(duì)照組＊＊△△☆☆

4 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞為襯貼于血管腔面的單層扁平上皮細(xì)胞，它沿著血管內(nèi)壁單層有序排列，直接與血液的各種成分相接觸，是血液、血流和血管三者相互聯(lián)系的界面和環(huán)節(jié)。研究表明，內(nèi)皮具有多種生理功能，參與機(jī)體的血管調(diào)節(jié)、凝血、纖溶、免疫、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和生物活性物質(zhì)釋放等生命活動(dòng)。血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷尤其內(nèi)皮細(xì)胞凋亡是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的早期事件，在冠心病的形成和發(fā)展中起重要作用［2］。內(nèi)皮細(xì)胞能合成和分泌多種血管活性物質(zhì)，如NO、ET等。NO對(duì)血管有擴(kuò)張作用，ET對(duì)血管有收縮作用，正常情況下二者保持動(dòng)態(tài)平衡，NO的作用略占優(yōu)勢(shì)，以保持血管壁的平滑和血流的通暢。內(nèi)皮細(xì)胞受到損傷時(shí)，NO和ET之間的動(dòng)態(tài)平衡受到破壞，NO生成量下降，ET表達(dá)量增加，導(dǎo)致微血管痙攣并阻塞血流。研究表明，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞、改善其生存狀態(tài)以及恢復(fù)其生理功能，對(duì)于防治冠心病有著重要的作用和意義［3-4］。

中醫(yī)認(rèn)為冠心病其病位主要在胸和心脈。胸在上焦，位屬于陽，為清陽所聚之處，內(nèi)藏心肺，為氣血活動(dòng)的源泉;心主血脈，血賴心脈的活動(dòng)而運(yùn)行全身以起濡養(yǎng)作用。若陽氣不足則血脈運(yùn)行失暢，心脈瘀阻;心脈瘀阻則陰血不足，心失所養(yǎng)，變生冠心病諸證。益氣活血法的立法源于《素問·陰陽應(yīng)象大論》有“定其血?dú)猓魇仄溧l(xiāng)，血實(shí)者宜決之，氣虛者宜掣引之”的論述。“方從法出，法隨證立”，氣虛血瘀證是冠心病最常見的證候，所以益氣活血法是冠心病的重要治法。補(bǔ)陽還五湯出自清代醫(yī)家王清任的《醫(yī)林改錯(cuò)》，所治之證系由中風(fēng)后氣虛不能推動(dòng)血行、氣虛血瘀，導(dǎo)致半身不遂、口眼歪斜等癥狀。補(bǔ)陽還五湯是益氣活血法的經(jīng)典方劑。方中重用生黃芪以大補(bǔ)肺脾胃之氣使氣血旺盛;配合少量的當(dāng)歸尾、赤芍、地龍、川芎、桃仁、紅花多種活血祛瘀藥逐瘀通絡(luò)，之所以用大劑量黃芪為主藥的目的，就是以補(bǔ)氣行血通絡(luò)。

本研究在探討益氣活血法對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)中，取法于補(bǔ)陽還五湯之方義，選用大劑量的黃芪注射液和小劑量的鹽酸川芎嗪注射液聯(lián)合用藥。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，二者聯(lián)用后可抑制缺氧損傷內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO，并抑制其分泌ET，從而發(fā)揮舒張血管的作用;聯(lián)合用藥的效果強(qiáng)于單用黃芪注射液和鹽酸川芎嗪注射液。

此外，本研究在實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，單用黃芪注射液有明確的保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用，但對(duì)改善內(nèi)皮細(xì)胞分泌功能的效果略差，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［5-6］。單用鹽酸川芎嗪注射液，大劑量的鹽酸川芎嗪注射液對(duì)正常的內(nèi)皮細(xì)胞有毒性，小劑量的鹽酸川芎嗪注射液也有保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用，功效不如黃芪注射液，但對(duì)改善內(nèi)皮細(xì)胞分泌功能效果優(yōu)于黃芪注射液。

臨床病證往往錯(cuò)綜復(fù)雜，單藥應(yīng)用往往難以收到滿意的效果，聯(lián)合用藥是臨床的必然趨勢(shì)。黃芪注射液和鹽酸川芎嗪注射液均為臨床常用的中藥注射液制劑，其有效性和安全性已經(jīng)過多年的實(shí)驗(yàn)室和臨床驗(yàn)證，臨床也時(shí)常兩藥聯(lián)用［7-8］，但一直缺少聯(lián)用的實(shí)驗(yàn)室研究。希望本研究的結(jié)果能為益氣活血法的治法以及黃芪注射液和鹽酸川芎嗪注射液的聯(lián)合用藥提供些許實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

［1］陳冰，李毅，商悅.葛根素對(duì)缺氧損傷的大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和功能的影響［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2009，15 (4):72-79.

［2］韓學(xué)杰，沈紹功.探討血管內(nèi)皮損傷致冠心病心絞痛的發(fā)生機(jī)理［J］.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2001，7(4):23-25.

［3］Yun-fei Liao，Yong Feng，Lu-Lu Chen，et al.Coronary heart disease risk equivalence in diabetesand arterialdiseases characterized by endothelial function and endothelial progenitor cell［J］.Journal of Diabetes and its Complications，2014，28 (2):214-218.

［4］俞慶三，李平.阿魏酸鈉對(duì)冠心病的療效及其對(duì)血管內(nèi)皮功能的保護(hù)作用［J］.中國(guó)生化藥物雜志，2012，22(3):480-482.

［5］楊富國(guó)，董果雄，張社華.黃芪注射液對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的保護(hù)作用［J］.中國(guó)微循環(huán)，2004，8(3):136-139.

［6］涂春香，謝佐福，陳江榮，等.黃芪注射液對(duì)煙堿損傷人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用［J］.福建中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，21 (4):19-20.

［7］梁同衍，劉俠.黃芪注射液聯(lián)合川芎嗪注射液對(duì)早期糖尿病腎病患者尿白蛋白排泄率及C反應(yīng)蛋白的影響［J］.中國(guó)藥物經(jīng)濟(jì)學(xué)雜志，2014，21(9):194-196.

［8］李乙根.黃芪注射液聯(lián)合川芎嗪注射液治療冠心病不穩(wěn)定型心絞痛46例臨床觀察［J］.新中醫(yī)，2008，40(6):35-36.

Protective Effect of Supplementing Qi and Activating Blood Circulation Method on Vascular Endothelial Cells in Hypoxia Injury

CHEN Bing，LI Yu-mei，ZHANG Li-shi，XUE Xin，MA Ya-luan△
(Institute of Basic Theory of TCM，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China)

Objective:To observe effects of the combination of astragalus injection and ligustrazine injection，which is used as the representative of Yiqi Huoxue method，on the protection of Human umbilical vascular endothelial cells (HUVECs)in anoxia injury.Methods:HUVEC were intervened with astragalus injection，ligustrazine injection or the combination，then these cells were treated with 100%nitrogen for 4 hours as the anoxia injury.Proliferation of HUVECs were detected by MTT.Apoptosis of HUVECs were analysed by AnnexinV-FITC/PI staining with flow cytometry.And the function of HUVEC by secretion of NO and ET were detected by ELISA.Results:Compared with model group，astragalus group，ligustrazine group and the combination group all can reduce the anoxia damage on HUVECs in different extent，by increasing the survival rate，decreasing the apoptosis rate and improving NO levels and lowering ET levels.Combination group works best in all groups.Conclusion:Yiqi huoxue method can effectively reduce the anoxia injury on HUVECs by improving their proliferation，inhibiting their apoptosis and improving their functions by regulating the secretion of NO and ET.

Yiqi Huoxue method;Human umbilical vein endothelial cells;Anoxia injury;Apoptosis

R543

:B

:1006-3250(2015)07-0794-03

2015-02-17

中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院自主選題研究項(xiàng)目(YZ-1408);中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院自主選題研究項(xiàng)目(YZ-1407)

陳 冰(1975-)，女，遼寧盤錦人，助理研究員，藥學(xué)博士，從事證候物質(zhì)基礎(chǔ)及方證相應(yīng)研究。

△通訊作者:馬雅鑾(1968-)，女，福建寧德人，研究員，醫(yī)學(xué)博士，從事中藥抗炎機(jī)制相關(guān)研究，Tel:010-64014411-2505，E-mail:yaluanma@163.com。