正交設計法篩選“腸病方”最佳刺激參數組合的研究*

閆麗萍， 冀來喜，祁 超，雙 源，燕 平

(山西中醫學院，太原 030024)

正交設計法篩選“腸病方”最佳刺激參數組合的研究*

閆麗萍， 冀來喜△，祁 超，雙 源，燕 平

(山西中醫學院，太原 030024)

目的:采用正交設計方法篩選電針治療腸黏膜損傷的最佳刺激參數組合。方法:制備大鼠腸黏膜損傷模型，以三因素三水平組合電針腧穴“腸病方”，觀察腸黏膜損傷指數及組織學變化。結果:各刺激參數治療作用的顯著性排列為電針頻率＞留針時間＞治療頻次，治療頻次影響不顯著。各因素中不同水平影響排序為:100 Hz＞30 Hz＞2 Hz;30 min＞20 min=10 min;每日2次、2 d 1次、每日1次均可。結論:電針腧穴“腸病方”治療腸黏膜損傷的最佳刺激參數組合為:100 Hz，30 min，每日2次。

“腸病方”;電針;正交設計;腸黏膜損傷

臨床研究表明，針灸對腸系疾病有較好的治療作用［1-2］。2009年在國家自然科學基金的資助下，冀來喜教授［3］等篩選出治療結腸黏膜損傷的最佳組方，即天樞、中脘、上巨虛三穴，并將其冠名為“腸病方”。然而針刺療效的影響因素除了不同的腧穴組方外，刺激量及時間等因素也非常重要。因此，在腧穴“腸病方”的基礎上，以正交設計方法進一步研究逆轉結腸黏膜損傷的電針頻率(2 Hz、30 Hz、100 Hz)、留針時間(10 min、20 min、30 min)、針刺間隔時間(每日1次、每日2次、2 d 1次)的最佳電針刺激參數組合，為臨床制定科學完善的針刺治療方案提供實驗室參考依據。

1 材料

1.1 動物

清潔級SD大鼠110只，體質量(180±20)g，雌雄各半，標準飼料喂養，動物及飼料均由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供(合格證編號SCXK (京)2012-0001)。

1.2 主要儀器

華佗牌SDZ-Ⅱ型電子針療儀(蘇州醫療用品廠有限公司);BM-VⅡ生物組織包埋機(孝感市宏業醫用儀器有限公司);BM-VⅡ冷凍臺(孝感市宏業醫用儀器有限公司);CS-VⅠ攤片烤片機(孝感市宏業醫用儀器有限公司);QP-V生物組織切片機(孝感市宏業醫用儀器有限公司);OLYMPUS-BX53正置熒光顯微鏡(日本奧林巴斯)。

1.3 主要試劑

冰乙酸(天津市北辰方正試劑廠);甲醛(天津市第三化學試劑廠);二甲苯(天津市第三化學試劑廠)。

2 方法

2.1 動物分組與造模

110只大鼠按隨機數字表法分為空白組(n= 10)、模型組(n=10)、針刺干預Ⅰ～Ⅸ組(均n= 10)。以上各組動物實驗前24 h禁食不禁水。造模時，將直徑為2 mm的聚氯乙烯管插入大鼠肛門內8 cm。模型組、針刺干預組取6%的冰醋酸1 ml灌腸，15 s后再灌入生理鹽水5 ml，建立急性結腸黏膜損傷大鼠模型［4］。空白組取生理鹽水1 ml灌腸，15 s后灌入生理鹽水5 ml。

2.2 處理方法

表1顯示，采用正交實驗設計方法［5］，針刺三因素三水平。表2顯示，按L9(34)正交表設計安排實驗。造模后即刻按表2的實驗安排對每組大鼠施以相應組合的針刺治療，正常組和模型組大鼠除與針刺干預組做同樣的抓取固定外，不做任何處理。針刺治療組每組針刺治療3次，末次治療24 h后麻醉取材。

表1 電針刺激參數

表2 針刺干預組9個亞組實驗安排表

取穴參照《實驗針灸學》［6］穴位標準定位。中脘:臍上20 mm;天樞(雙側):臍中［7］旁開5 mm;上巨虛(雙側):大鼠后肢足三里向下約5 mm。

2.3 觀察指標

2.3.1 結腸黏膜損傷指數 各組大鼠以20%烏拉坦(0.6 ml/100 g)腹腔注射麻醉固定，沿腹白線剪開大鼠腹腔，剪下距肛門12cm結腸，生理鹽水沖洗，觀察結腸黏膜損傷情況，計算結腸黏膜損傷指數［8］。

2.3.2 組織學觀察 將大鼠距肛門8 cm處表面積約1 cm×1 cm左右的結腸(腸壁全層)剪下，置于10%的甲醛溶液中固定，HE染色，普通光鏡下觀察腸黏膜的損傷程度。

2.4 統計學方法

應用SPSS 17.0統計軟件進行統計分析，組間比較采用秩和檢驗(M±QR)，正交分析采用方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠結腸黏膜損傷指數、組織學評分結果

各組大鼠 2項評分經正態性檢驗，均 P＜0.001，表明數據均不滿足正態性，故采用秩和檢驗。經兩兩秩和檢驗比較均P＜0.05，說明針刺干預組和空白組、模型組比較差異有統計學意義，具有可比性。

表3 各組結腸黏膜損傷指數、組織學評分秩和檢驗

3.2 正交試驗結果

表4～6顯示，因素 A、B影響顯著(均 P＜0.05)，因素C影響不顯著(P＞0.05)。由F值可得出三因素影響的主次順序為A＞B＞C(電針頻率＞留針時間＞治療頻次)，因素A和B對本項指標結果有顯著性影響(均P＜0.05)，其中A3、B3最為適合;因素C對結腸黏膜損傷指數的影響不顯著(P＞0.05)，3個水平均可。但本模型是急性損傷，結合針灸臨床經驗以及急性病癥治療效果考慮每日2次為宜，故電針“腸病方”逆轉大鼠急性結腸黏膜損傷的最佳刺激參數組合為A3B3C2，即100 Hz、30 min、每日2次。

表4 不同針刺干預方法對大鼠結腸黏膜損傷指數及組織學評分的影響

4 討論

電針治療疾病的療效，與腧穴配伍、電針頻率、留針時間、治療頻次等因素密切相關。

頻率是電針刺激的重要參數之一，不同頻率電針可通過不同的神經化學機制，由不同的中樞通路整合而產生的效應不同［9-10］。本實驗結果表明，電針頻率對改善大鼠結腸黏膜損傷具有顯著影響，100 Hz電針頻率療效優于2 Hz、30 Hz，即100 Hz電針頻率可以較好地改善腸黏膜的損傷。

在刺激強度相同情況下，刺激時間在一定范圍內與有效刺激量正相關［11］。雖然目前關于留針時間與電針治療腸病療效方面的文獻較少，但留針時間與電針的療效有密切聯系［12］。本實驗結果表明，留針時間對結腸黏膜損傷的影響顯著。在本實驗的3個水平中，留針時間越長，受損的結腸黏膜恢復情況越好，30 min的留針時間明顯優于10 min、20 min。這可以說明，電針留針時間偏短則治療結腸黏膜損傷效果不佳，只有達到一定的留針時間才會產生明顯療效。

表5 不同針刺干預方法對2項評分指標影響的正交試驗直觀分析

表6 不同因素對2項指標影響的方差分析

不同的針灸治療頻次可以反映針灸刺激量的積累。一般來說，急性病癥來勢急驟且兇猛，病情嚴重，機體受到損傷嚴重，這就需要相對應較高頻次的針灸治療。慢性病變機體受致病因素的作用時間長，這就需要較長的治療過程來積累針灸治療的效果，逐步消除損害。但并非所有疾病都能這樣一概而論，這就需要我們具體到某種疾病詳細研究對其的針灸治療頻次。本實驗結果表明，治療頻次在改善2項指標方面均無顯著影響。古代針灸醫籍中有“氣至而有效”、“氣速至而速效”的說法，對于發病急、病情重的疾病，需要在短時間內累積足夠的針灸效應。因此，基于本研究模型為急性損傷造成，結合針灸臨床經驗以及急性病癥治療效果考慮，認為在改善結腸黏膜損傷方面，治療頻次選擇每日2次比較符合需要。

在本實驗中，電針頻率與留針時間是影響“腸病方”治療急性腸黏膜損傷療效的顯著因素，治療頻次是不顯著因素。電針“腸病方”的最佳刺激參數組合為，電針頻率100 Hz，留針時間30 min，治療頻次每日2次，而其作用機制則有待進一步深入研究。

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［2］王寶琛，高忠波，王善旭.溫針灸治療潰瘍性結腸炎52例［J］.河南中醫，2011，30(10):1105.

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［4］馬貴同，詹劍烈.中醫中藥治療潰瘍性結腸炎臨床及實驗研究［J］.中醫雜志，1985，26(7):33.

［5］趙天平，口鎖堂，馬曉芃，等.正交設計研究艾灸對潰瘍性結腸炎大鼠穴區溫度和Cx43表達的作用［J］.上海針灸雜志，2010，29(6):335-338.

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［7］王海軍，冀來喜.關于大鼠神闕穴的定位［J］.針刺研究，2007，32(5):312.

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Study on Optimum Acupuncture Parameter for“Changbingfang”by Orthogonal Design

YAN Li-ping，JI Lai-xi△，QI Chao，SHUANG Yuan，YAN Ping
(Shanxi University of Traditional Chinese Mendine，Taiyuan 030024，China)

Objective:Combination of parameters of the using the orthogonal design method to screening the best stimulus electro-acupuncture treatment of intestinal mucosa injury.Methods:Rat intestinal mucosal injury model，Index of intestinal mucosal injury and ordinary optical microscope observation from the cellular level damage to the intestinal mucosa，as observed indicators，factors and three levels orthogonal design method electro-acupuncture acupoints best to enteropathy side screened electrical stimulation parameters.Results:The importance of the stimulation parameters in descending arranged of“Changbingfang”is frequency of electric acupuncture＞retaining time of acupuncture needles＞interval of acupuncture，but the treatment frequency effect was not significant.The sequence of each level in 3 element is: 100 Hz＞30 Hz＞2 Hz;30 min＞20min=10 min;1 time/d，2 times/d and 1 time/2 d have the same effects.Conclusion: The best combination of stimulation parameters for treat bowel disease about acupoints“Changbingfang”is:100 Hz，30 min，2 times/d.

“Changbingfang”;Electro-acupuncture;Orthogonal experimental design;Intestinal mucosa injury

R245.9+7

B

1006-3250(2015)01-0080-03

2014-09-24

國家自然科學基金資助項目-基于針刺信號傳導途徑與整合機制的腧穴“腸病方”配伍研究(30973799)

閆麗萍(1967-)，女，山西左云人，副教授，醫學碩士，從事腧穴組方的研究。

△通訊作者:冀來喜(1964-)，男，山西保德人，教授，主任醫師，醫學博士，從事腧穴組方的研究，E-mail:Tyjilaixi@126.com。