基于脂肪干細胞的再生醫學用于治療糖尿病的研究

彭觀球，佘妙琴，蔡祥勝

廣東省惠東人民醫院 急診科，廣東 惠東 516300

糖尿病是一種慢性疾病，在全球范圍內影響超過3.47億人[1-4]。由于高脂肪和高糖飲食以及久坐不動的生活方式，糖尿病發病率不斷上升。此外，每年由糖尿病及其并發癥造成的經濟負擔超出1000 億美元。最常見的治療Ⅰ型和一些Ⅱ型糖尿病的方法是胰島素治療。強化胰島素治療可以維持正常血糖，并控制急性低血糖癥以及長期并發癥[5]，但是不能達到正常的血紅蛋白A1c水平。在血糖商業化監測方面，胰島素制劑、胰島素泵的進步也改進了對糖尿病癥狀[5]的控制。然而，即使采用廣泛使用的胰島素治療，糖尿病患者的預期壽命平均比非糖尿病個體[6]約短12年。此外，那些Ⅰ型糖尿病發病的孩子，視網膜病變、腎病、神經性病變、各種心血管和外圍血管疾病的風險增加顯著[5-6]。

Ⅰ型糖尿病是由胰島中的朗格爾漢斯細胞破壞能產生胰島素的β細胞造成的自身免疫性疾病，治療Ⅰ型糖尿病的更明確方案是胰腺或胰島移植[8]。一個多世紀前，采用胰腺提取物在第一個糖尿病患者中進行了移植試驗[9]。現代胰腺和胰島移植可以比較有效地使空腹和餐后血糖水平、血紅蛋白A1c水平及胰島素和C-肽的生產恢復正常[6]。然而，嚴重缺少可用的捐贈者限制了這種治療方法的推廣[5]，只有0.5%的Ⅰ型糖尿病患者能從此受益[10]。此外，長期的免疫抑制和使用免疫抑制劑引起的副作用，如腎毒性、高血壓和過敏感染，常常導致患者產生非醫從性[5,10]。最后，對胰島β細胞自身免疫的再次發生，仍然是一個主要的與移植療法相關的挑戰[6]。

干細胞分離和分化的最新進展已獲得一種新的細胞系，這種細胞通過響應葡萄糖來合成、封裝和分泌胰島素。作為一種多能干細胞，胚胎干細胞（ES細胞）常向多種細胞譜系分化發育，導致目標細胞在混合細胞群中[6]。ES 細胞不含明確的內胚層標志物，而未分化的致畸ES 細胞也可造成嚴重風險[6,10]。由于道德和法律關注以及畸胎瘤形成的風險，胚胎干細胞進入臨床仍然面臨嚴峻挑戰[11]。

現已知多潛能祖細胞定位于許多不同器官[12]。由于具有多能性，成體干細胞提供了一個比較可靠的來源間充質干細胞用于細胞療法[13]。在眾多組織來源的成體干細胞中，脂肪組織來源的干細胞（adipose-derived stem cells，ADSC）由于含有大量的干細胞和易于通過微創和相對便宜的方法獲得，因而具有更大的吸引力[14]。骨髓和脂肪組織來源的間充質干細胞具有類似的細胞群和細胞特性[15]。據報道，在單位重量上脂肪組織比骨髓含有更大數量的間充質干細胞[3]。這篇綜述主要介紹脂肪干細胞在治療糖尿病和糖尿病并發癥方面的進展。

1 直接分化成分泌胰島素的β細胞

Kodama 等[16]提出了胰島的4 種再生機制：①成熟的β細胞復制；②干細胞分化；③細胞融合；④干細胞轉分化為另一種干細胞。大多數研究細胞為基礎的治療重點放在將干細胞直接分化成產生胰島素的β細胞。

源自脂肪組織的間充質干細胞表現出適合轉分化成胰腺內分泌譜系的獨特的特點。新鮮分離的脂肪來源的干細胞也表達干細胞因子（SCF）及其受體（c-kit）[14]，但不表達ABCG2、巢蛋白、THY-1 和ISL-1。Lin 等[3]報道，脂肪干細胞組成型表達胰高血糖素、NEUROD及胰島素。另外，增殖的脂肪干細胞表達轉錄因子ISL-1 和Pax-6，這是β細胞發育所需的關鍵轉錄因子[14]，先前的研究表明，在ISL-1 敲除小鼠的發育過程中胰島素和胰高血糖素陽性細胞的形成受到抑制。脂肪干細胞增殖也表達干細胞標志物巢蛋白、ABCG2、SCF 和Thy-1。巢蛋白最初被認為是一種神經干/祖細胞標志物，但最近有報道認為這是一種在胰腺胰島內的多能胰腺干細胞標志物[7]。ABCG2 還顯示與胰島衍生的前體細胞和神經干細胞相關[5]。Kojima 等[17]證實胰腺外產生胰島素的細胞能表達胰島素原和胰島素，來源于由鏈脲霉素誘導的患糖尿病的嚙齒動物的脂肪組織中。基于這些內在特征，脂肪干細胞分化后可以作為有前景的胰腺源激素生產細胞來源。

通過對關鍵步驟的胚胎發育和協調的激活期間細胞內轉錄因子的了解，使干細胞分化成為胰島素生產細胞成為可能。像胚胎干細胞[18]，從ADSC分化成為胰島素生產細胞是通過一個漸進多級分化方案進行的：從明確的內胚層到胰腺內胚層，最后成為胰腺激素表達細胞[2,14,19]。已有使用各種組合培養條件刺激脂肪干細胞成胰島素產生細胞譜系的報道。

所有報告所述分化細胞群的染色陽性為雙硫腙，表明存在內源性胰島素。此外，這些干細胞來源的胰島素分泌細胞大量表達PDX-1、C-肽、胰島素、胰高血糖素、生長抑素、胰多肽及轉運蛋白2[2,14]。已證實在分化的細胞中，ISL-1、Pax-4、NGN-3、IPF-1、Pax-6、NKX-2.2、NKX-6.1、FOXA2、GLP-1 受體和葡萄糖激酶增強表達，提示向胰腺譜系分化[2,7,14]。

將人類ADSC 衍生胰島素產生細胞移植入經鏈脲佐菌素引起的糖尿病小鼠中后，檢測到顯著的人C-肽水平，證明體內成功地產生了胰島素。雖然這些分化細胞表現出降低血糖水平的能力，但是與成熟的胰島相比，其胰島素分泌水平仍然較低，也未能使STZ誘導的糖尿病小鼠回復正常血糖[3,14,19]。

脂肪干細胞分化為胰島素分泌細胞類似于成熟的自身胰腺細胞也仍然受到質疑。Dor 等[20]用遺傳譜系追蹤方法確定在成體中胰腺干細胞是否補充胰島β細胞。在這項研究中，他們證明了在小鼠體內，末端分化成熟的β細胞維持其增殖能力，并作為新的β細胞的主要來源，與先前的報道相反[21]。雖然這項研究直接否定了在實施部分胰腺切除術后，多能成年干細胞取代β細胞在體內的作用；但它并不直接排斥體外分化成體干細胞后分化為產生胰島素的細胞的應用，作為用于糖尿病的潛在新治療選擇，這已有許多研究報道。

2 移植胰島的植入

胰島移植的成功與否取決于將供體的胰島移植到受體肝臟地方，通過肝門靜脈輸送。但是，細胞凋亡、炎癥和缺血頻繁干擾植入的成功[22]，因此，2個或2個以上的胰腺經常需要采購足夠數量的胰島來移植。考慮到供體器官嚴重短缺，這是限制這種療法的主要原因。由于不可避免地破壞胰島原生結構，其中包括胰島內血管，分離期間，胰島移植可能需要幾個星期[23]。進一步惡化的胰島和β細胞死亡可能是由于缺血和炎癥，最終導致移植失敗[24]。改善移植胰島的植入會減少所需胰島的數量，得到更積極的臨床結果。

脂肪干細胞已被報道通過其分泌的營養因子而具有內在的再生血管生成的潛力和抗凋亡能力[25]。脂肪干細胞還具有抗炎和調節免疫的特性，包括抑制T 細胞增殖[8]。因此，ADSC 可以改善移植增強血管生成和抑制胰島炎癥。

Ohmura等[24]將腎包膜下的自體脂肪干細胞與同種異源小鼠胰島共移植，自體小鼠脂肪干細胞能顯著延長同種異體胰島長達14 d，達到正常的血糖水平。單獨移植胰島不能存活超過2 d，也沒有實現正常血糖。混合移植胰島保存了完好的胰島結構，且被內皮細胞包繞，提示血管生成改善。當脂肪干細胞聯合移植供體胰島細胞時，CD4+/CD8+T細胞的浸潤和CD68的表達也明顯減少，這意味著通過延長移植胰島細胞的存活可調節抗炎和免疫作用[24]。雖然還不確定混合移植方法是否能成為臨床工作模式，但利用肝門靜脈胰島移植而不是腎膠囊，在胰島移植中使用ADSC有巨大的潛在益處。

Veriter 等[26]將靈長類動物的ADSC 和異種豬胰島封裝在半透膜膠囊中，并移植到靈長類動物體內。相比于單獨封裝胰島，聯合移植能改善氧合、移植物的存活和功能、糖化血紅蛋白校正，并觀察到包裹植入物內血管新生，從而減少移植后細胞應激[26]。

即使使用了免疫抑制，胰島通過門靜脈灌注到人體肝臟后在最初10～14 d 中大量丟失[27]；此外，據報道60%的移植胰島在此期間死亡，即使是同種動物模型[28]。Ohmura[24]、Veriter[26]和Cavallari 等[29]證明，使用ADSC 能夠防止早期移植死亡，對胰島移植成功是非常有益的。

3 脂肪來源的干細胞在糖尿病治療中的挑戰和機遇

基于干細胞的細胞治療糖尿病的幾個不確定因素依然存在：①不存在黃金標準，可重復的用于從成體干細胞分化為產生胰島素的細胞的方案；②精確量化干細胞衍生的β細胞逆轉糖尿病的條件和在體外可以精確量化；③增殖能力和維持分化產生胰島素的細胞；④敏感性反調節激素；⑤潛在的未分化的成體干細胞的不利作用；⑥潛在的體內分化的細胞植入后的遷移[4]。

一個主要的挑戰還在于模仿生理胰島素分泌的機制。胰島素分泌通過復雜的監管體系，涉及多個激素反饋機制和神經刺激，包括胰島內朗格爾漢斯細胞。例如，β細胞分泌胰島素能抑制由α細胞分泌的高血糖素[30]，由δ細胞分泌的生長抑素也調節β細胞[31]分泌胰島素。為了模仿正常或接近正常的代謝控制，分化細胞必須能夠與現有的胰腺內分泌細胞相互作用。控制胰島素釋放的另一種機制是通過腸促胰島素分泌激素，包括葡萄糖依賴性促胰島素肽和胰高血糖素樣肽[1,5,32]。這些腸道信號激素參與70%的葡萄糖誘導的餐后胰島素分泌[32]。對這些信號作出反應的能力也是一個干細胞衍生的β細胞需要擁有的關鍵特性，從而更接近生理過程。最后，胰島素分泌是搏動，而不是一個恒定的釋放，并且這種搏動的作用是非常重要的[33]。干細胞分化成胰譜系，簡單地產生胰島素，即使具有葡萄糖反應的特性，卻沒有能力來適應這些復雜的相互作用，將無法扭轉糖尿病癥狀。

天然胰島的一般結構對于分化產生胰島素的細胞的效率也是一個挑戰。人體胰島含有豐富的血管和神經，而體外培養時，干細胞來源的胰島樣結構迄今還沒有表現出含有任何內在血管。β細胞和毛細管間的距離可潛在地影響胰島素釋放的動力學，非生理整合胰島樣結構可能會反過來影響植入、存活即植入物[34]的功效。β細胞釋放胰島素不僅受到增加的血糖水平影響，而且通過神經調節，大多期間通過膳食攝取[6]膽堿能神經元。即使整個器官或胰島移植，由于缺乏神經支配，胰島素分泌的頭側相的完全恢復將是失敗的[35]。克服這些結構性難題至關重要，從而使干細胞衍生的β細胞或胰島在未來臨床上變為可行。

幾乎所有從成體干細胞衍生的產生胰島素的細胞共表達胰高血糖素、促生長素抑制素、胰多肽和胰島素，這都是朗格爾漢斯未成熟胰島的特點。這是一個不完整的分化干細胞，并且可能這些細胞是糖尿病動物無法回復正常血糖水平的一個主要原因還需要進一步的細胞分化和成熟，從而實現與正常相似的胰腺功能的替代。然而，有人還認為治療糖尿病可能不需要終末分化成熟的β細胞。Konno等[36]和Kajiyama 等[37]報道了移植脂肪來源的干細胞過表達PDX-1能改善高血糖和提高成活率。此外，外生胰腺移植使血紅蛋白A1c 水平正常化，并隨后減輕或部分逆轉由糖尿病引起的神經和腎臟的損害[5]實現血紅蛋白A1c水平的正常也可能被證明是未來基于細胞療法的關鍵。

糖尿病具有一個獨特的不利于各種細胞類型的環境。據報道，從鏈脲霉素誘導的Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病大鼠脂肪組織分離的間質干細胞增殖能力受到抑制[38]。如果脂肪干細胞植入后肢缺血模型之前是暴露于體外高葡萄糖濃度的，相比于在一個正常的葡萄糖濃度培養的細胞，其增殖能力和扭轉下肢缺血的能力顯著和不可逆地減少[38]。在Ⅰ型糖尿病患者中，自身免疫似乎沒有從根本上影響胰島和其祖細胞的再生能力[13]。Hess 等[39]表明，骨髓來源的干細胞通過刺激受者的先天胰腺細胞祖細胞和β細胞增殖來啟動胰腺再生和逆轉高血糖。脂肪干細胞極有可能具有同樣的機制，需要進一步觀察。使用脂肪干細胞提高胰島的相對再生能力將可能使糖尿病患者受益。

從干細胞在體外分化為胰島樣細胞或胰腺樣組織的移植可伴隨移植排斥反應、移植肥厚、慢性低血糖和潛在惡性轉化。共移植脂肪干細胞時，其內在免疫調節功能增強了多個類型植入組織的移植成功率[40]。Vanikar 等[40]報道，脂肪干細胞可能會減少腎移植時免疫抑制劑的需求量。減少所需的免疫抑制劑的用量，可以將這些試劑引起的并發癥降到最低并改善胰島移植臨床結果。

大約90%的糖尿病患為Ⅱ型糖尿病。然而，由于Ⅰ型糖尿病一直是研究的前沿，只有少數基于干細胞的研究是用于治療Ⅱ型糖尿病的[41]。相對于開發治療Ⅱ型糖尿病的替代方法，使用從干細胞衍生的胰島素分泌β細胞用于治療Ⅰ型糖尿病似乎相對直截了當。對Ⅱ型糖尿病復雜的疾病機制和干細胞應用的關聯的進一步研究，可以提高數以億計的患者的生活質量。

4 結語

不可否認，脂肪干細胞應用于糖尿病的治療是非常有前途的。豐富可用的組織來源，含量高和多能的脂肪間充質干細胞，其營養和再生能力，都可以為不斷增加的糖尿病人群和相關的健康危機提供解決方案。理解脂肪干細胞及其發育的基礎，對于糖尿病的治療仍然被認為是在處于起步階段，眾多挑戰和機遇仍在前面。從脂肪干細胞產生胰島素的細胞，以及進一步向功能性胰島產生的確切機理還需要深入探討。可持續的分化成產生胰島素的細胞仍在研究中。自身免疫攻擊的β細胞，這是一個基本的Ⅰ型糖尿病的發病機制，還沒有得到完全解決，并且可以使任何未來的基于細胞的治療不可行。

目前采用胰島素注射和胰島移植治療糖尿病都不是患者真正的最佳選擇。干細胞在數量和多能性上為未來治療數百萬糖尿病患者提供了無限的理論上的可行性和希望。然而，如果所有的以干細胞為基礎的治療僅省去了葡萄糖監測和輕度改善糖尿病的癥狀，那么在未來就沒有理由把這些療法用于臨床。因此，基于干細胞的治療必須能夠從根本上改善多方面代謝的控制，改善糖尿病患者的長期預后，才能被廣泛接受作為一種臨床上可行的療法。

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