長鏈烷烴降解菌C6的鑒定及性能研究

呂立君，王光華，李文兵，盧露露，劉念汝，陳 彪

（武漢科技大學 化學工程與技術學院，湖北 武漢 430081）

長鏈烷烴降解菌C6的鑒定及性能研究

呂立君，王光華，李文兵，盧露露，劉念汝，陳 彪

（武漢科技大學 化學工程與技術學院，湖北 武漢 430081）

從含油活性污泥中篩選出一株長鏈烷烴降解菌C6，進行了菌種鑒定，考察了該菌對正十六烷及柴油和石蠟的混合物的降解能力，并對由菌株C6產生的生物表面活性劑進行了鑒定。實驗結果表明：該菌為鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii）；對液體培養基中質量濃度為1 000 mg/L的正十六烷降解48 h后，降解率接近100%，降解動力學曲線的擬合結果符合Monod模型；對液體培養基中質量濃度為1 000 mg/L的柴油和石蠟的混合物降解96 h后，降解率達93%；菌株C6產生的生物表面活性劑經FTIR分析鑒定為磷脂類表面活性劑，排油圈直徑為60 mm，臨界膠束質量濃度約為25 mg/L，可將水的表面張力降至27.09 mN/m。

長鏈烷烴；含油活性污泥；菌種篩選；生理生化鑒定；降解動力學；生物表面活性劑

長鏈烷烴是嚴重破壞生態環境的有機污染物之一，由于其化學性質穩定、疏水性強、常溫常壓下為固體，很難自然降解，易對環境造成長期的危害。經污水廠處理后的石化廢水仍含有大量的長鏈烷烴，作為循環水使用時可將長鏈烷烴帶入新一輪的生產中。劉雪琴［1］采用生物活性炭技術處理武鋼焦化廠二沉池廢水，反應后仍有部分長鏈烷烴未被徹底降解。對武鋼焦化廠蒸氨塔原水及引用的中水采用氣相色譜-質譜聯用技術進行定性分析，發現長鏈烷烴均來自中水。通過針對未降解的長鏈烷烴持續篩菌，完善復合菌系，可達到更好的生化處理效果。由于長鏈烷烴的疏水性，需篩選出一株能產生表面活性劑的菌株，以降低長鏈烷烴與水的表面張力。生物表面活性劑除了具有良好的降低表面張力、乳化、發泡的特性外，還具有易生物降解、無污染的優點［2］。不同的菌株產生不同的生物表面活性劑。根據親水基的不同，表面活性劑可分為糖脂類，脂肽類，磷脂類，脂肪酸類，結合多糖、蛋白質和脂的聚合物等5類［3］。

本工作從含油活性污泥中篩選出一株能產生表面活性劑的長鏈烷烴降解菌，對其進行了菌種鑒定，研究該菌對正十六烷及柴油和石蠟的混合物（簡稱柴蠟混合物）的降解能力，并對由該菌株產生的生物表面活性劑進行鑒定與性能研究。

1 實驗部分

1.1 試劑、材料和儀器

正十六烷：色譜純；柴油、石蠟：分析純。含油活性污泥：取自中國石化武漢石油（集團）股份有限公司曝氣池。

LB培養基：酵母浸提物5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1 L。pH為6.8～7.2，于121.3 ℃下濕熱滅菌20 min后備用。

無機鹽培養基：硝酸銨1 g，磷酸氫二鈉1.42 g，磷酸二氫鉀1.36 g，七水硫酸鎂0.432 g，氯化鈣0.006 g，微量元素混合液1 mL，蒸餾水1 L。pH為6.8～7.2，于121.3 ℃下濕熱滅菌20 min后備用。其中，微量元素混合液成分為一水硫酸錳1.69 g/L，六水氯化鈷0.24 g/L，硼酸1.16 g/L，二水鉬酸鈉0.024 g/L，七水硫酸亞鐵2.78 g/L，七水硫酸鋅1.15 g/L，五水硫酸銅0.38 g/L。

在上述培養基中分別加入質量分數為2%的瓊脂，得到相應的固體培養基。

Agilent 6890型氣相色譜儀：德國安捷倫有限公司；UV-2000型紫外-可見分光光度計：上海美普達儀器有限公司；JK99型全自動張力儀：上海忠臣數字設備技術有限公司；Mastercycler gradient VERTEX 70型傅里葉變換紅外光譜儀：德國Bruker有限公司。

1.2 長鏈烷烴降解菌的篩選及鑒定

向采集到的含油活性污泥中加入一定量的蒸餾水，離心10 min，取適量上清液接種于以正十六烷（質量濃度為500 mg/L）為唯一碳源的100 mL LB液體培養基中，于溫度35 ℃、轉速125 r/min的恒溫搖床中培養36 h。取4 mL菌液接種于以正十六烷（質量濃度為500 mg/L）為唯一碳源的100 mL無機鹽培養基中，于溫度35 ℃、轉速125 r/min的恒溫搖床中培養一段時間，反復操作，使正十六烷質量濃度從500 mg/L逐步提高至5 000 mg/L。取適量富集培養液，稀釋后均勻涂布在LB固體培養基平板上。待有明顯菌落出現后，采用平板劃線分離法分離單菌落。

挑取單一菌落接種于正十六烷質量濃度為1 000 mg/L的無機鹽培養基中，于溫度35 ℃、轉速125 r/min的搖床中振蕩48 h。采用氣相色譜儀檢測剩余正十六烷的質量濃度，選出降解率最高的菌株C6。

按照文獻［4］報道的方法對菌株C6進行16S rDNA分子遺傳學鑒定。

1.3 長鏈烷烴降解菌對正十六烷和柴蠟混合物的降解

將優勢菌C6按4%（φ）的接種量接種于正十六烷質量濃度為1 000 mg/L的無機鹽培養基中，于溫度35 ℃、轉速125 r/min的恒溫搖床中培養，定時取樣，測定菌體生長曲線和正十六烷質量濃度。

在相同實驗條件下，采用菌株C6降解質量濃度為1 000 mg/L的柴蠟混合物。

1.4 表面活性劑的提取

按照文獻［5］報道的方法，從接種菌株的正十六烷無機鹽培養基中提取表面活性劑并純化。

1.5 分析方法

以菌體培養液在600 nm處的吸光度（OD600）表征培養液中的菌體濃度。

采用氣相色譜儀測定正十六烷的質量濃度。色譜條件：進樣口溫度300 ℃，檢測器溫度300℃，柱溫150 ℃保持1 min，以10 ℃/min的升溫速率梯度升溫至280 ℃，進樣量1 μL。

采用全自動張力儀測定表面張力。

采用紫外分光光度法［6］，在225 nm處測定柴蠟混合物的吸光度，計算柴蠟混合物的質量濃度。

按照文獻［7-8］報道的方法測定生物表面活性劑的排油活性、乳化性和臨界膠束質量濃度。按照文獻［9］報道的方法對生物表面活性劑進行FTIR分析。采用薄層層析法對生物表面活性劑進行薄層分離，根據不同顯色劑的顯色結果判斷生物表面活性劑的種類［9］。

2 結果與討論

2.1 長鏈烷烴降解菌的16S rDNA鑒定

通過提取菌株C6的基因組DNA，將篩選出的PCR產物送武漢擎科有限公司測序。測序后獲得總長為1 414 bp的16S rDNA基因片段，該序列在GenBank中的登陸號為KR072555。

菌株C6的16S rDNA序列與不動桿菌屬（Acinetobacter sp.）的16S rDNA序列相近，同源性大于98%。因此，初步鑒定菌株C6為不動桿菌屬（Acinetobacter sp.）。

將菌株C6的16S rDNA序列與GenBank中相關序列進行BLAST相似性分析，對同源性高的11株菌株用Mega軟件以相近序列構建系統發育樹。菌株C6與Acinetobacter baumannii IBL-4C6處于同一支。因此，鑒定菌株C6為鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii）。

2.2 菌株C6對正十六烷的降解

正十六烷的降解曲線和菌株C6的生長曲線見圖1，正十六烷無機鹽培養基的表面張力見圖2。

圖1 正十六烷的降解曲線和菌株C6的生長曲線● 正十六烷質量濃度；■ OD600

圖2 正十六烷無機鹽培養基的表面張力

由圖1和圖2可見：菌株C6的生長趨勢與正十六烷的降解過程基本同步，表明菌株C6能以正十六烷作為唯一碳源促進自身生長，并對正十六烷進行降解；降解時間為0～12 h時，OD600較低，主要是因為正十六烷不溶于水，在降解初期，細胞與底物之間的接觸受限，妨礙了底物的代謝速率，導致菌體生長速率緩慢；降解12～36 h時，OD600迅速增加，正十六烷質量濃度逐漸降低，在此階段菌株C6分泌出生物表面活性劑，該表面活性劑對正十六烷具有增溶作用，將正十六烷無機鹽培養基的表面張力降至27 mN/m左右；降解36 h后，菌株C6的生長進入穩定期；降解48 h后，正十六烷基本降解完全，降解率接近100%，菌株C6因缺少碳源而進入衰亡期。

2.3 菌株C6降解正十六烷的動力學方程

采用Monod方程建立菌株C6對正十六烷的降解模型［10-11］。Monod方程表明了底物濃度和降解速率的定量關系，見式（1）。

式中：v和vmax分別為底物生物降解速率和最大底物生物降解速率，mg/（L·h）；K為底物半飽和系數，mg/L；ρ為底物質量濃度，mg/L。

以1/ρ為橫坐標，1/v為縱坐標，得到1/v～1/ρ的關系曲線，見圖3。1/v～1/ρ的關系曲線方程為y=5.35x+0.013 5，相關系數為0.998。由圖3求得截距1/vmax=0.013 5，得出vmax=74.1 mg/（L·h）；斜率K/vmax=5.35，可得K=396.3 mg/L。由此可見，得到菌株C6降解正十六烷的動力學方程為v=74.1ρ/（396.3+ρ）。

圖3 1/v～1/ρ的關系曲線

2.4 菌株C6對柴蠟混合物的降解

柴蠟混合物的降解曲線見圖4。由圖4可見：降解時間為0～36 h時，降解速率較快，柴蠟混合物質量濃度由1 000 mg/L降至500 mg/L以下，柴蠟混合物中短鏈烷烴基本降解完全；降解時間為36～96 h時，降解速率下降，推測可能是由于烷烴碳鏈長度的增加，降解難度增大；經過96 h的降解，柴蠟混合物降解率達93%，比馬秋莎等［12］報道的柴蠟混合物降解率高6%。表明菌株C6對廢水中長鏈烷烴的降解有很高的應用價值，達到了篩菌目的。

2.5 生物表面活性劑的性能分析

由正十六烷無機鹽培養基中提取到的生物表面活性劑呈淡黃色粉狀，排油圈直徑為60 mm，臨界膠束質量濃度約為25 mg/L，可將水的表面張力降至27.09 mN/m。

生物表面活性劑的FTIR譜圖見圖5。由圖5可見，3 442 cm-1處出現了O—H鍵的吸收峰，1 644 cm-1處出現了NH+的吸收峰，1 531 cm-1和1 398 cm-1處出現了C=O鍵的吸收峰，1 107 cm-1處出現了PO—R鍵的吸收峰，667 cm-1處出現了P=S鍵的吸收峰。結合Robert等［13］的研究結果和薄層層析法的鑒定結果，判定菌株C6產生的表面活性劑為磷脂類表面活性劑。

圖4 柴蠟混合物的降解曲線● 柴蠟混合物質量濃度；■ 柴蠟混合物降解率

圖5 生物表面活性劑的FTIR譜圖

3 結論

a）從含油活性污泥中篩選出一株長鏈烷烴高效降解菌C6。經鑒定該菌為鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii）。

b）菌株C6對液體培養基中質量濃度為1 000 mg/L的正十六烷降解48 h后，降解率接近100%，降解動力學符合Monod模型。

c）菌株C6對液體培養基中質量濃度為1 000 mg/L的柴蠟混合物降解96 h后，降解率達93%。說明菌株C6對長鏈烷烴有良好的降解作用。

d）菌株C6產生的生物表面活性劑經鑒定為磷脂類表面活性劑，排油圈直徑為60 mm，臨界膠束質量濃度約為25 mg/L，能將水的表面張力降至27.09 mN/m。

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（編輯 王 馨）

Identification and Characteristics of Long-Chain Alkane Degrading Strain C6

Lü Lijun，Wang Guanghua，Li Wenbing，Lu Lulu，Liu Nianru，Chen Biao
（College of Chemical Engineering and Technology，Wuhan University of Science and Technology，Wuhan Hubei 430081，China）

The long-chain alkane degrading strain C6 from oily activated sludge was identified. Its degradation abilities to n-hexadecane and the mixture of diesel and paraffin were studied，and the bio-surfactant produced by it was characterized. The experimental results show that：Strain C6 is Acinetobacter baumannii；After n-hexadecane with 1 000 mg/L of mass concentration in medium is degraded for 48 h，the degradation rate is nearly 100%，and the degradation kinetic curve meets the Monod model；After the diesel and paraff i n mixture with 1 000 mg/L of mass concentration in medium is degraded for 96 h，the degradation rate is 93%；The bio-surfactant produced by strain C6 is characterized by FTIR and identif i ed as phospholipids with 60 mm of oil spreading size，25 mg/L of critical micelle mass concentration （CMC）and the water surface tension is decreased to 27.09 mN/m by it.

long-chain alkane；oily activated sludge；strain screening；physiological and biochemical identif i cation；degradation kinetics；bio-surfactant

X172

A

1006-1878（2015）05-0487-05

2015 - 05 - 23；

2015 - 06 - 29。

呂立君（1990—），女，湖北省武漢市人，碩士生，電話 15926487793，電郵 927712226@qq.com。