一氧化氮對動物胚胎附植影響的研究

魏　東， 孫全文

（河北北方學院實驗動物中心， 張家口　075000）

一氧化氮對動物胚胎附植影響的研究

魏東， 孫全文

（河北北方學院實驗動物中心， 張家口075000）

一氧化氮（NO）作為一種特殊的生物傳遞信號分子，日益受到生命科學各領域的普遍重視。機體內的NO由一氧化氮合酶催化合成，是動物體內發揮多種生物學效應的自由基，是一種重要的生物信使，它幾乎對哺乳動物的所有系統都會產生一定的作用。近幾年的研究結果表明，NO對動物胚胎附植發揮著重要作用。

一氧化氮（NO）； 胚胎附植； 一氧化氮合酶

一氧化氮（NO）是人們熟知的大氣污染物之一。近年來， 國內外的研究者做了很多關于NO對動物生理功能影響的研究， 發現內皮源性舒張因子（endothelium-derived relaxing factor， EDRF）的化學本質為NO，以其廣泛而重要的生物學作用成為研究熱點； 同時，作為一種自由基性質的生物活性分子， NO也是目前在動物體內發現的最小、最輕、最簡單、有重要生理功能的生物信息分子， 幾乎存在于所有類型的組織細胞中， 是調節血管功能和炎癥反應、介導組織重建和細胞凋亡、影響胚胎發育和附植等多種生理過程的重要旁分泌調節因子［1，2］。

附植是整個妊娠最重要的一個環節，是哺乳動物囊胚滋養層細胞與母體子宮上皮細胞之間逐步建立組織生理上聯系的過程，成功附植有賴于胚泡與母體相互識別、胚泡發育與母體子宮變化的同步以及抑制母體的免疫排斥反應和母體接受性等一系列反應［3］。近年來，學者們對NO在胚胎早期發育及附植過程中可能產生的生理調節作用做了大量的研究，并獲得重大進展。

1　NO的生化性質

NO分子量僅30 000，是一種重要的生理功能信使分子， 結構簡單， 性質不穩定， 易運動， 生物半衰

NO是一種不帶電荷，含一個未配對電子的自由基，性質活潑，參與體內多種反應，是生物系統中不可缺少的基本分子之一。NO在體內由一氧化氮合酶（NO synthase，NOS）催化合成。NOS以L-精氨酸和分子氧為底物，催化L-精氨酸的兩個等價胍氮之一，經5電子氧化反應生成NO和L-瓜氨酸。NO以旁分泌方式（paracrine）作用于相鄰組織。因此NO的局部含量主要取決于該組織中NOS的活性、數量和亞型，而目前通常按組織來源和表達方式將NOS分為神經元型NOS（neuronal NOS nNOS）、內皮型NOS（endothelial NOS，eNOS）誘導型NOS（indueible NOS，iNOS）和結構型NOS （constitutive NOS，cNOS）［5］。

NO具有親脂性，可透過細胞膜擴散到臨近的靶細胞中，并作用于細胞中的水溶性鳥苷酸環化酶，與該酶亞鐵血紅素分子中的鐵離子結合，激活該酶，使環磷酸鳥苷（cGMP）的產量增多。而cGMP是體內中重要的第二信使之一，它可產生一系列生理反應。NO的效應途徑是多種多樣的，除廣泛存在的NO/cGMP系統外，還存在NO/COX、NO/PKC、NO/IRP等調節系統。

NO在各種雌性動物的繁殖過程中發揮著重要的調節劑作用， 如妊娠的維持、分娩、胎盤的生長發育、調節基本促性腺激素釋放激素（gonadotropinreleasing hormone， GnRH）的產生、刺激促黃體生成素（luteotropic hormone，LH）的分泌、卵泡的發育及妊娠期間血液流量［6］，其參與多種細胞信號傳遞路徑［7］。實驗證明，環磷酸腺苷（cAMP）/cGMP的比例變化對胚胎的生長發育和分化具有重要的調節作用［8］。NO刺激鳥苷酸環化酶，促使cGMP生成，是cAMP/cGMP比例的主要調節者，是胚胎正常發育所必需。同時，血管內皮生長因子和成纖維細胞生長因子都依賴NO生成量的多少來調節子宮和胎盤的血流， NO通過擴張臍動脈血管而使胎兒胎盤血流量增加，加速氧和營養物質的輸送，以利于胎兒的生長，NO是胎盤血流、氧和營養物質交換的關鍵因子。研究表明在綿羊妊娠的30 d到60 d間，胎盤NO的合成顯著增加； 從妊娠l00 d開始增加綿羊胎盤NO的合成，可顯著增加胎盤胎兒血流，加快胎兒的增長［9］。因此，NO代謝水平可以作為監測胚胎發育是否正常的一項重要指標。

2　NO對胚胎附植的促進作用

胚泡附植是一個母體和胚胎都主動參與的生理過程，其發生既決定于胚泡的主動性，也決定于子宮內膜是否做好準備，兩者的同步化，才能使胚泡的附植順利進行，而胚胎發育不良和子宮環境不適宜都會導致附植失敗。NO正是從調節胚胎發育和子宮環境兩方面參與附植過程。首先，NO是胚胎分裂分化的調節因子。Gouge等［10］檢測了小鼠附植前胚胎產生NO的能力，首次證明了NO在調節胚胎附植方面的重要性和對于正常胚胎發育的必要性。Sanyal等［11］的實驗表明，當將一定濃度的NO供體硝普鈉（sodium nitroptusside，SNP）加入到培養基時能顯著增加絨毛膜癌JEG-3細胞的增殖并抑制滋養層細胞的分化，證明了nNOS在人滋養層細胞的存在和NO在囊胚細胞增殖和分化中的作用?；|金屬蛋白酶-2 （MMP2）是一種啟動附植和胎盤形成的必需成分。Novaro等［12］的實驗表明，iNOS在接近子宮上皮MMP2表達增多的位點即在附植前囊胚的表面被表達。NO供體增加MMP2在培養的子宮組織碎片中的活性，而NOS抑制劑使MMP2活性下降，結果證明囊胚產生的NO有助于子宮MMP2的產生。

廖海艷等［13，14］在小鼠胚胎附植期通過子宮角注射NOS的非特異性抑制劑N-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）和L-NAME+SNP方法研究了NO對小鼠胚胎植入的影響，結果表明，與對照側相比，L-NAME處理組植入胚胎數降低，在L-NAME中加入NO供體SNP時，則不影響胚胎植入數； NO作為一種內源性平滑肌松馳劑和血管擴張劑，可以通過局部調節子宮內膜金屬蛋白酶（MMP-9）的表達而參與胚胎植入過程的調節，對MMP-9 mRNA的表達有著極為顯著的調節作用，并進一步影響子宮內膜發育和胚胎的附植。

在哺乳動物早期胚胎發育過程中，附植前和附植過程中都能檢測到與NO相關的酶類。Novaro等［15］觀察到Ca2+依賴型NOS （eNOS）的活性在胚胎附植的前幾天逐漸增加， 非Ca2+依賴型NOS （iNOS）的活性僅在附植開始時增加，接著兩者的活性均下降，表明NO在附植過程中發揮重要作用，NO的產生對于胚胎附植成功是必要的。

為了進一步闡明NO促進胚胎附植的機制，Zhang等［16］通過明膠酶譜法及RT-PCR發現經NOS抑制劑L-NAME處理后，小鼠胚胎圍植入期子宮基質金屬蛋白酶-9（MMP9）、血管內皮生長因子（VEGF）及其受體mRNA的表達有不同程度的下降；當L-NAME與供體SNP同時注射小鼠時，MMP9、VEGF及其受體mRNA的表達都恢復到正常水平。結果表明，N O在小鼠胚胎植入中可通過調節MMP9、VEGF及其受體的表達參與血管新生，從而對胚胎植入起到調節作用。同時也表明，阻止NO的產生，附植就不能正常發生。

在胚胎發育和附植過程中，胚胎中多種亞型的NOS共同起作用，而eNOS可能在此過程中發揮主要作用。據報道［17］，單個NOS基因敲除的小鼠植入前胚胎發育無異常， 而雙基因（eNOS/iNOS，eNOS/nNOS，iNOS/nNOS）敲除的小鼠胚胎在發育過程中最先損失。這說明雖然鼠胚胎多種亞型的NOS可以起代償作用，但胚胎自身產生NO對于早期鼠胚發育是必需的。NO調節胚胎發育的精確機制還不明了。Chen等［18］觀察到至少兩種NOS（eNOS和iNOS）在正常小鼠早期胚胎有表達，其在囊胚期免疫染色強于2-、4-細胞期和桑椹胚。NO/ cGMP信號傳導通路在植入前胚胎發育中尤其重要，而L-NAME能抑制早期囊胚發育。Tranguch等［17］證實植入前各期鼠胚胎均有eNOS表達。NO缺乏或cGMP過多能抑制胚胎發育但不引起DNA損傷， 說明NO至少部分通過cGMP途徑調節胚胎發育［19］。這些研究表明， NO及其各亞型（主要是eNOS）在胚胎附植過程中可能起著重要的調節作用。

另外，附植是否成功，子宮的環境也發揮重要作用，子宮血管通透性的增強是附植的一個標志，子宮充足的血液供給對于胚胎附植是十分必要的。在血管中，NO由eNOS催化合成，是有效的血管擴張和血小板抑制因子。附植前子宮NOS活性明顯增加，附植發生時附植點子宮組織中eNOS和iNOS含量也顯著上升，說明NO參與子宮微環境的建造［20］。孕酮（progesterone，P4）和雌二醇（estrogen，E2）誘導子宮支持妊娠，使附植處發生劇烈的組織重塑（tissue remodeling），而NO作為P4和E2的下游效應分子［21］，在重塑中也參與了血流量、毛細血管通透性及免疫抑制狀態的調節。

3　NO對胚胎附植的抑制作用

適量濃度的NO是正常胚胎發育所必需的，但當其失衡時則會導致胚胎發育阻滯或凋亡。研究表明［22，23］，高濃度的NO對早期胚胎的發育有害。Barroso等［24］研究顯示， DETA/NO注入小鼠體內， 會導致小鼠胚胎附植以劑量依賴的方式抑制，在每日注入20 mmol/L劑量DETA/NO的小鼠沒有觀察到附植位點， 而對照組小鼠有81.8%的附植率， 結果表明，高濃度的NO既能抑制小鼠胚胎的體外發育又可抑制胚胎的體內附植。Athanassakis等［25］使用IFN-γ、TNF-α、LPS、5-AzaC和DF4胚胎毒性因子誘導早期胚胎產生了NO，這與iNOS或eNOS的誘導有關。研究還證實，在流產婦女某些系統的血清中發現了NO的胚胎毒特性，這種胚胎毒性導致NO在早期胚胎死亡中起潛在作用，而NO過量產生也表明其是脂多糖誘導的胎兒排斥機制的一部分。

此外，NO與免疫調節的關系也很密切。受抗原、細菌脂多糖（LPS）及細胞因子的刺激，機體的多種免疫細胞表達iNOS。Ogando等［26］研究表明，在LPS誘導的早期胚胎吸收模型中，小鼠胚胎植入位點表達iNOS，蛻膜巨噬細胞也表達iNOS口服或注射NOS的抑制劑氨基胍（AG），可以降低LPS誘導的早期胚胎吸收。由此可推測，子宮局部高濃度的NO可能作為一種效應分子介導早期胚胎吸收過程。由iNOS催化底物生成的高濃度NO具有細胞毒性作用，能夠損傷胚胎，支持胚胎被吸收。這些研究結果表明NO在調節胚胎發育中起“雙刃劍”作用。

4　結語

雖然NO不是調節胚胎附植過程的唯一介導者（還有許多NO之外的機制參與），但作為一種重要的信使分子，NO從胚胎發育和影響子宮環境兩方面參與胚胎附植，NO的濃度對不同階段的胚胎發育狀態有不同影響，用適當的方式增加NO/NOS對調節發育有重要的影響，這將為調控動物繁殖技術的深入研究提供良好的理論基礎。

目前， 雖然對NO的許多作用機制， 特別是其對生殖活動的影響還不是很清楚，但隨著對動物模型NO/NOS的深入研究， 必將加深人們對其性質、生理功能、作用機理的認識， 對于了解NO對胚胎附植過程的作用分子機理有極其重要的意義，同時也可以為提高胚胎附植率、動物產仔數及NO相關疾病的治療提供重要的理論依據， 從而有助于動物醫學和人類臨床醫學領域進一步闡明機體某些生理功能調節及某些疾病的發生機制以及許多疑難病變的治療提供新的思路。另外， 在新藥開發、提高動物繁殖性能等方面， NO也將會展示出廣闊的應用前景

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Effects of Nitric Oxide on Embryonic Implantation in Animals

WEI Dong， SUN Quan-wen
（Laboratory Animal Center， Hebei North University， Zhangjiakou075000， China）

Nitric oxide （NO） is a special biological signal molecule，it is being paid attention to the life sciences in various fields. The NO of the organism is synthesized by catalysis of nitric oxide synthase （NOS）. NO is a free radicals in body playing a variety of biological effects， and an important biological messenger producing certain effects in almost all systems of mammals. The recent researches show that NO plays an important role on animal embryo implantation.

Nitric oxide； Embryonic implantation；Nitric oxide synthase

Q95-33

A

1674-5817（2015）04-0341-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.04.021

2015-05-31

魏東（1971-）， 男， 博士， 副研究員， 研究方向: 基礎獸醫學。E-mail: hbzjkwd@163.com期短（約為3s～5s），溶解度隨水溶液的離子強度增加而降低，在正常體溫與動物組織細胞內外液離子強度的條件下，NO溶解度約為1.55 mmol/L［3］，NO以溶解于水的狀態存在于組織細胞內外液中。NO具有疏水性，而生物膜有疏水性結構，NO在生物膜中的溶解度比在水中高6～7倍。NO不帶電荷可以自由通過生物膜。有的學者認為［4］生物膜可當作細胞內外液中的NO貯存部位，但是在病理、生理情況下生物膜中的NO較在細胞內外液更能顯示毒性作用。