肺癌患者血清和胸水中Dickkopf-1的表達及臨床意義

李銀鵬　石芳　楊婧　劉政

作者單位: 065000河北省廊坊市，中國石油中心醫院呼吸科

肺癌患者血清和胸水中Dickkopf-1的表達及臨床意義

李銀鵬石芳楊婧劉政

作者單位: 065000河北省廊坊市，中國石油中心醫院呼吸科

【摘要】目的探討肺癌患者血清以及胸水中Dickkopf-1(DKK-1)的表達，以及其在臨床應用中的診斷價值。

方法選取2011年3月至2012年4月呼吸科肺癌82例，良性病變者38例。酶聯免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測肺癌以及肺部良性病變患者血清以及胸水中DKK-1的濃度，比較肺癌與肺部良性病變患者血清以及胸水中DKK-1的表達情況。結果肺癌患者血清以及胸水中DKK-1的含量均較肺部良性病變患者顯著增高(P＜0.05)。血清中與胸水中DKK-1的表達正相關(r =0.72，P＜0.05)。血清以及胸水中DKK-1用于診斷肺癌以及肺癌骨轉移的敏感性及特異性均較高。非小細胞肺癌(NSCLC)患者予以正規化療2個療程后患者血清中DKK-1表達降低(P＜0.05)。結論DKK-1有望成為肺癌以及肺癌骨轉移的診斷與治療新的靶點。

【關鍵詞】DKK-1;肺腫瘤;酶聯免疫吸附法;骨轉移

E-mail: keaiduo68@163.com

肺癌是嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤，其發病率及病死率在世界范圍內占腫瘤性疾病的第一位［1］，雖然近年來肺癌的早期診斷以及治療方面取得了一些進展，但肺癌的總體預后仍然很差，其5年生存率總體不超過15%［2］。因此尋找理想的肺癌診斷、治療、預后的指標具有重要的臨床意義。Dickkopf-1(DKK-1)為一種分泌型糖蛋白，有研究表明DKK-1在肺癌患者的血清中高表達，有望成為肺癌診斷以及評價預后的新的血清學指標［3］，本研究通過檢測肺癌患者血清以及胸水中DKK-1的表達探討其臨床意義。

1　資料與方法

1.1一般資料收集2011年3月至2012年4月在我院呼吸科住院患者120例，其中男78例，女42例;平均年齡(63±12)歲。肺癌患者82例，良性病變患者38例。肺癌患者均經病理證實，腺癌37例，小細胞肺癌21例，鱗癌24例;伴有胸膜轉移引起胸水28例，伴有骨轉移31例。患者均為初診患者且未經過放化療，并排除合并有其他惡性腫瘤。肺癌的分期按美國癌癥聯合委員會癌癥分期(TNM)手冊(2009，第7版)制定的原則［3］，Ⅰ期14例，Ⅱ期11例，Ⅲ期10例，Ⅳ期47例。對照組為同期住院良性病變患者38例，包括肺部感染15例，肺結核8例，結核性胸膜炎15例伴有胸水。

1.2檢測方法患者入院第2天清晨抽取靜脈血5 ml，室溫下放置30 min，1 500 r/min，離心10 min，取上清液放入－70℃冰箱保存，待測。胸腔積液患者入院后行胸腔穿刺時收集胸腔積液15 ml，同時次日清晨抽取靜脈血，同樣按照上述方法處理標本，待測。試劑及儀器:人DKK-1ELISA檢測試劑盒購蘇州科創生物技術有限公司(美國RayBiotech生物公司生產)，具體操作步驟嚴格按照試劑說明進行操作，酶標儀購自美國Biorad公司。

1.3統計學分析應用SPSS 13.0統計軟件，計量資料以x±s表示，各組之間DKK-1濃度的比較采用獨立樣本t檢驗，化療前后采用血清中DKK-1濃度的比較采用配對t檢驗，腫瘤各種類型以及分期之間DKK-1濃度的比較采用單因素方差分析，P＜0.05差異有統計學意義。

2　結果

2.12組患者血清中DKK-1濃度肺癌患者血清DKK-1濃度為(36±17)ng/ml，明顯高于肺部良性病變患者(11±7)ng/ml，差異有統計學意義(P＜0.01)，而在肺部良性病變中肺部感染(9±6)ng/ml與肺結核(14±9)ng/ml患者血清DKK-1的濃度比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。

2.22組患者胸水中DKK-1濃度肺癌伴胸膜轉移引起胸水以及結核性胸膜炎患者胸水中DKK-1濃度分別為(31±17)ng/ml和(14±7)ng/ml，差異有統計學意義(P＜0.05)。而在肺癌伴有胸水的患者中肺腺癌(28±12)ng/ml，小細胞肺癌(36±21)ng/ml，鱗癌(19±5)ng/ml之間兩兩比較，差異均無統計學意義(P＞0.05)。43例(肺癌28例，結核性胸膜炎15例)患者同時收集外周血及胸水的DKK-1濃度分別為(27 ±17)ng/ml VS(34±20)ng/ml，通過雙變量相關分析二者呈正相關(r =0.72，P＜0.05)。見圖1。

圖1　肺癌患者血清以及胸腔積液中DKK－1濃度的相關性

2.3血清及胸水中DKK-1對肺癌的診斷價值應用ROC曲線計算血清中DKK-1診斷肺癌的最佳臨界值為19.22 ng/ml，其敏感度為83.3%，特異度為82.1%，其曲線下面積為0.931，同樣胸水中DKK-1診斷肺癌的最佳臨界值為15.42 ng/ml，其敏感度為87.9%，特異度為70%，其曲線下面積為0.832，見圖2。

圖2　血清以及胸水中DKK－1診斷肺癌的ROC曲線

2.4血清中DKK-1濃度對肺癌骨轉移的診斷價值31例肺癌伴有骨轉移患者DKK-1濃度較無骨轉移者顯著升高，進一步通過ROC曲線計算肺癌骨轉移血清中DKK-1診斷肺癌骨轉移的最佳臨界值為36.76 ng/ml，其敏感度為80.6%，特異度為78.4%，曲線下面積為0.843。見圖3。

圖3　血清中DKK－1濃度診斷肺癌骨轉移ROC曲線

2.5化療前后血清DKK-1濃度的變化15例Ⅳ期肺癌患者分別于第1次及第3次化療前抽取靜脈血檢測其DKK-1的濃度化療后(32±18)ng/ml較化療前(48 ±21)ng/ml血清中DKK-1濃度明顯降低(P＜0.01)。

2.6DKK-1濃度與肺癌臨床特征之間的關系肺癌患者中不同性別，吸煙狀況患者之間DKK-1濃度差異無統計學意義(P＞0.05)，而在組織學類型中鱗癌與小細胞肺癌患者之間差異有統計學意義(P＜0.05)，其余各種腫瘤之間差異無統計學意義(P＞0.05)。在不同腫瘤分期，有無淋巴結轉移，以及有無骨轉移的患者中DKK-1濃度差異有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

3　討論

DKK-1為Wnt傳到通路拮抗劑，為一種分泌型糖蛋白，其通過與Wnt蛋白競爭結合LRP5/6受體而直接抑制Wnt蛋白活性，進而來調控細胞的分化、增殖、

表1　DKK-1濃度與肺癌臨床特征　±s

表1　DKK-1濃度與肺癌臨床特征　±s

項目　DKK-1(ng/ml)　P值性別男(n =55)　38±19　＞0.05 女(n =27)　36±17吸煙無(n =32)　36±17　＞0.05 有(n =50)　40±20組織學類型腺癌(n =37)　38±19　＞0.05小細胞肺癌(n =21)　44±20　＜0.05鱗癌(n =24)　31±12分期Ⅰ～Ⅱ(n =32)　28±12　＜0.05Ⅲ～Ⅳ(n =50)　44±18淋巴結轉移無(n =45)　29±14　＜0.05 有(n =37)　47±17骨轉移無(n =51)　29±18　＜0.05 有(n =31)51±17

遷移或癌變等特性，在腫瘤發生方面發揮重要作用［4，5］，有大量的研究表明，DKK-1在肺癌患者血清以及肺癌標本中高表達［6］，其在肺癌患者血清以及標本中的異常表達可能為肺癌的早期診斷、治療及其預后提供了新的理論基礎。同樣本研究通過檢測肺癌患者血清及胸水中DKK-1的濃度提示，在肺癌患者血清中DKK-1高表達，且在晚期、伴有淋巴結及骨轉移的患者中表達更高。且予以正規化療后DKK-1濃度降低，同樣在胸水中較結核性胸膜炎患者肺癌伴有胸腔積液的患者DKK-1濃度更高。同時血清及胸水中DKK-1的濃度檢測對肺癌的診斷的敏感性及特異性均較高。

本研究通過ELISA檢測82例肺癌患者血清中DKK-1濃度，發現肺癌患者血清DKK-1濃度為(36± 17)ng/ml，明顯高于肺部良性病變患者的(11±7)ng/ml，差異有統計學意義(P＜0.01)，研究結果與Sheng等［7］通過免疫熒光測量法檢測592例惡性腫瘤患者、72例良性肺部疾病患者及120名健康患者血清中DKK-1的提示肺癌患者血清的DKK-1濃度顯著高于肺部良性病變患者的結果一致，同時Sheng等［7］進一步研究發現血清DKK-1的含量與腫瘤的組織分型及患者的年齡和性別無關，而與腫瘤的分期、淋巴結轉移及遠處轉移相關。

而本研究發現性別以及吸煙與否對DKK-1的濃度無影響，同樣肺癌晚期(Ⅲ～Ⅳ)，伴有淋巴結轉移的患者中其DKK-1濃度顯著高于肺癌Ⅰ～Ⅱ期，無淋巴結轉移的患者。在腫瘤的分型中本研究發現小細胞肺癌患者血清中DKK-1含量高于肺鱗癌此研究結果與Yamabuki等［6，7］的研究提示DKK-1含量與肺癌組織學類型無關的結果不一致，考慮可能是本研究肺癌患者病例數相對較少有關。

大部分肺癌患者在第1次診斷的時候，37%的患者有局部進展，38%的人有遠處轉移［8］，30%～65%的遠處轉移患者將有骨轉移［9］，骨轉移導致一些致死性的并發癥，即所謂的骨相關事件(SREs)［10］括疼痛、病理性骨折、神經根壓迫、脊髓壓迫、高鈣血癥，嚴重影響患者的生活質量，因此對于肺癌骨轉移的早期診斷以及及時有效的治療，對于臨床醫生是極其重要的而Wnt通路的規范途徑是骨誘導性傳導通路，Wnt通路的信號傳導在整個成骨細胞分化過程中扮演著重要的角色。DKK-1是一種分泌蛋白，是wnt通路規范途徑的抑制因子。Lee等［11］報道DKK-1在骨肉瘤組織中高表達，Tian等［12］發現DKK-1表達在

有溶骨損傷的多發性骨髓瘤組織中，Hall等［13］對前列腺癌患者血清DKK-l蛋白進行檢測，發現在骨轉移前，血清DKK-1蛋白水平升高;在前列腺癌骨轉移的患者中，DKK-1蛋白表達水平的高低與患者生存期負相關。但國內外關于DKK-1在肺癌骨轉移患者中的表達情況未見相關報道，本研究根據患者入院后骨ECT檢查結果以及患者臨床表現確診為肺癌骨轉移患者31例其血清中DKK-1濃度為(51±17)ng/ml較無轉移51例患者(29±18)ng/ml顯著增高，進一步通過ROC曲線計算出在臨界點為36.76 ng/ml，其診斷肺癌骨轉移敏感度為80.6%，特異度為78.4%，其曲線下面積為0.843，因此可以推測通過檢測血清中DKK-1的濃度用于肺癌骨轉移的診斷具有重要的臨床意義。

大部分肺癌患者在出診的時候已經處于晚期，因此目前對于肺癌的主要治療手段為化療以及靶向治療［14］，Yamabuki等［6］學者通過免疫組織化學的方法檢測279例非小細胞肺癌患者細胞內DKK-1的含量，進行生存分析，結果提示DKK-1的表達高低與患者的生存負相關，但肺癌患者在化療前后血清中DKK-1含量的如何變化，目前研究甚少，本研究首先通過檢測肺癌患者第1次及第3次化療前血清中DKK-1的表達量發現化療后其濃度為(32±18)ng/ml較化療前(48 ±21)ng/ml顯著降低(P＜0.01)，同時本研究通過體外的細胞實驗同樣得出在順鉑作用前后肺癌細胞株其細胞上清中DKK-1表達減少故推測化療后患者DKK-1濃度的降低可能對患者的預后有積極的意義，同時Yamabuki等［6］進一步研究DKK-1可促進細胞的侵襲能力，盡管其通過與LRP5/6受體而直接抑制Wnt通路，理論上講應該是抑制腫瘤，但DKK-1可能與細胞表面其他未知的分子結合，而發揮其侵襲能力。

胸腔積液是肺部多種疾病的并發癥，大約20%的胸腔積液是惡性腫瘤引起的，其中的50%是原發性肺癌［15］。同時大約20%的肺癌患者最初的臨床表現為胸腔積液，目前胸水找脫落癌細胞可作為肺癌伴有胸腔轉移以及診斷肺癌的標準，但是由于癌細胞在積液中午組織及器官結構的束縛經過不停地繁殖失去了原來的細胞形態，加上胸水中本身存在大量的淋巴細胞以及間皮細胞，因此胸水診斷肺癌的細胞學檢查敏感性很低［16］，目前在臨床上最常見用于診斷惡性胸腔積液的為CEA［17］，但其單獨用于診斷肺癌其結果仍不能令人滿意，本研究首先檢測肺癌血清中DKK-1的濃度，同時檢測28例肺癌伴有胸腔積液的患者以及結核性胸膜炎的患者發現，肺癌伴有胸腔積液其胸水中DKK-1濃度為(31±17)ng/ml較結核性胸膜炎患者胸腔積液中DKK-1(14±7)ng/ml，差異有統計學意義(P＜0.01)。同時通過ROC曲線計算得出胸水中DKK-1診斷肺癌的最佳臨界值為15.42 ng/ml，其敏感度為87.9%，特異度為70%，進一步通過雙變量相關分析得出血清中與胸水中DKK-1的濃度正相關(r =0.72，P＜0.05)，因此可以得出DKK-1在肺癌伴胸腔積液的診斷中具有重要的臨床意義，且檢測方法簡單易行容易被患者接受，因此DKK-1可能成為肺癌的診斷甚至靶向治療的新的熱點。

綜上所述，通過肺癌患者血清以及胸腔積液中DKK-1通過ELISA檢測較肺部良性病變患者顯著增高，且血清以及胸腔積液中DKK-1用于診斷肺癌的敏感性及特異性均較高，肺癌伴有骨轉移患者血清中DKK-1含量較無骨轉移者顯著升高，且血清中DKK-1用于診斷骨轉移其敏感性及特異性好，因此DKK-1有望成為肺癌診斷甚至治療的新靶點。

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Expression and clinical significance of DKK-1 in serum and hydrothorax of patients with lung cancer

LI Yinpeng，SHIFang，YANG Jing，et al.
Department of Respiratory Diseases，Petroleum Clinical Medical Collage of Hebei Medical University，Hebei，Langfang 065000，China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression levels of Dickkopf-1(DKK-1)in serum and hydrothorax of patients with lung cancer，and to explore its clinical diagnostic value.MethodsEighty－two patients with lung cancer (observation group)and 38 patients with pulmonary benign lesion (control group)who were admitted into department of respiratory disease of our hospital from March 2011 to April 2012 were enrolled in the study.The levels of DKK-1 in serum and hydrothorax were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)for both groups.Results The levels of DKK-1 in observation group were significantly increased，as compared with those in control group (P＜0.05).The expression levels of DKK-1 in serum were positively correlated to those in hydrothorax (r =0.72，P＜0.05).Both sensitivity and specificity of DKK-1 in diagnosis of lung cancer were higher.The levels of DKK-1 were obviously decreased in patients with NSCLC after two treatment courses by routine chemotherapy (P＜0.05).ConclusionDKK-1 is hopeful to become an new target point for diagnosis and treatment of lung cancer

【Key words】DKK-1; lung neoplasms; enzyme-linked immunosorbent assay; bone metastasis

(收稿日期:2014－10－20)

通訊作者:劉政，065000河北省廊坊市，中國石油中心醫院呼吸科;

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.06.004

【文章編號】1002－7386(2015)06－0815－04

【文獻標識碼】A

【中圖分類號】R 734.2