CXCL12-CXCR4生物軸與卵巢癌關系的動物實驗研究

郭清　吳小華　鐔麗霞　楊波　呂英璞　徐峰　張少靜

作者單位: 050011河北省石家莊市第一醫院婦產科(郭清、鐔麗霞、呂英璞、徐峰、張少靜);中國人民解放軍白求恩國際和平醫院婦產科(吳小華、楊波)

CXCL12-CXCR4生物軸與卵巢癌關系的動物實驗研究

郭清吳小華鐔麗霞楊波呂英璞徐峰張少靜

作者單位: 050011河北省石家莊市第一醫院婦產科(郭清、鐔麗霞、呂英璞、徐峰、張少靜);中國人民解放軍白求恩國際和平醫院婦產科(吳小華、楊波)

【摘要】目的探討CXCL12-CXCR4趨化因子軸與卵巢癌發病的關系。方法將36只裸鼠按照體重大小編號，隨機分為3組，將轉染質粒SKOV3/CXCR4、轉染載體SKOV3/neg及未轉染的SKOV3三種卵巢癌細胞進行體外培養，取三種細胞懸液4×106個(200 μl)于裸鼠左下腹注入腹腔，建立荷人卵巢癌細胞裸鼠腹腔移植瘤模型。自注入腫瘤細胞后第2天起，將每組裸鼠又隨機分為對照組和處理組，對照組腹腔內注射0.9%氯化鈉溶液0.2 ml，處理組腹腔內注射CXCL12-CXCR4拮抗劑AMD3100，觀察各組裸鼠自然死亡后腹腔成瘤數、體積、腹水量和存活期的變化。結果SKOV3/CXCR4、SKOV3/neg及SKOV3三種卵巢癌細胞接種于裸鼠腹腔后1周左右荷瘤裸鼠在對照組和處理組體重差比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。接種SKOV3/CXCR4細胞的裸鼠對照組的平均生存期與CXCR4拮抗劑AMD3100處理組裸鼠比較，差異有統計學意義(Z =－2.29，P＜0.05);而接種SKOV3/neg細胞的裸鼠對照組的平均生存期與CXCR4拮抗劑AMD3100處理組裸鼠比較，差異無統計學意義(P＞0.05);接種SKOV3細胞的裸鼠平均生存期與CXCR4拮抗劑AMD3100處理的裸鼠比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。接種SKOV3/CXCR4細胞裸鼠的對照組腹腔移植瘤的平均個數和平均重量與CXCR4拮抗劑AMD3100處理組比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。結論CXCL12-CXCR4趨化因子軸與卵巢癌的發生有一定的相關性，可能是其發病的一個重要原因，在一定程度上也反映了病情的輕重。

【關鍵詞】CXCL12; CXCR4;卵巢腫瘤

E-mail: xiaohuawu64@ yahoo.com

趨化因子CXCL12與其特異性受體CXCR4構成的CXCL12-CXCR4生物軸在多種腫瘤的播散和器官特異性轉移中發揮著重要作用。Kijima等［1］研究證實，CXCL12-CXCR4生物軸與卵巢表面上皮的惡性轉化有關，約80%的卵巢癌組織中有CXCL12的受體CXCR4的表達，在95%的卵巢癌腹水中發現CXCL12，而正常的卵巢上皮中卻沒有表達。本研究以裸鼠為研究對象進行動物試驗，來更好地說明兩者之間的相關性，為卵巢腫瘤的發病機制提供新的依據，為其治療提供新的靶點。

1　材料與方法

1.1材料來源

1.1.1腫瘤細胞:卵巢漿液性囊腺癌細胞SKOV3由河北醫科大學第四醫院科研中心提供; SKOV3/CXCR4細胞、SKOV3/neg細胞由本課題組前期制備［2］。

1.1.2實驗動物:購自中國醫學科學院實驗動物中心，合格證編號: SCXK(京)2005-0013。

1.2方法

1.2.1穩定表達趨化因子受體CXCR4卵巢癌細胞株的建立與鑒定:具體構建與鑒定方法參考文獻［3］。

1.2.2細胞培養: SKOV3/CXCR4、SKOV3/neg、SKOV3三種細胞常規培養在含10%胎牛血清、青霉素100 U/ml和鏈霉素100 g/ml的RPMI-1640培養液中; 在37℃、5%CO2條件下孵育;以0.25% (w/v)的胰蛋白酶消化傳代。

1.2.3SKOV3/CXCR4、SKOV3/neg、SKOV3三種細胞裸鼠腹腔移植瘤模型的建立和治療: 4～6周齡，體重16～18 g，將36只裸鼠按照體重大小編號，隨機分為三組，取三種細胞懸液4×106個(200 μl)于裸鼠左下腹注入腹腔。自注入腫瘤細胞后第2天起［4，5］，將每組裸鼠又隨機分為對照組和處理組，對照組腹腔內0.9%氯化鈉溶液0.2 ml，處理組腹腔內注射CXCR4拮抗劑AMD3100，用量0.01 mg/g，每只裸鼠每次注射0.2 ml;同時每組均腹腔內注射CXCL12 0.2 ml，濃度為100 ng/ml，每2天注射1次，連用2周共7次。

1.2.4荷瘤裸鼠生長狀態的觀察:荷瘤裸鼠接種細胞后，每日觀察裸鼠的精神狀況、皮膚、飲食、活動能力等，于移植腫瘤后第7天起隔日測量裸鼠的腹圍、體重，觀察腹腔移植瘤生長情況，計算2組小鼠的生存天數。

1.2.5荷瘤裸鼠然死亡后的解剖情況:對自然死亡裸鼠進行解剖，檢查腹水、心、肝、脾、肺、腎、腦、子宮卵巢、腹膜、橫隔、網膜、腸系膜等臟器腫瘤轉移情況，同時觀察腹腔成瘤數、重量情況。

1.3統計學分析應用SPSS 17.0統計軟件，計量資料以±s表示，對各組數據進行單因素方差分析，采用t檢驗，兩兩比較應用SNK-q檢驗，裸鼠平均存活天數的比較采用完全隨機設計多個樣本比較的Kruskal-Wallis H檢驗，對各組數據組間行配對t檢驗，P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1荷瘤裸鼠的體重對比SKOV3/CXCR4、SKOV3/neg及SKOV3三種卵巢癌細胞接種于裸鼠腹腔后1周左右荷瘤裸鼠的腹圍相無明顯的差異，3組裸鼠的對照組和處理組體重差比較差異有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1　3種裸鼠的對照組和處理組體重差比較n =6，g±s

表1　3種裸鼠的對照組和處理組體重差比較n =6，g±s

類別　對照組　處理組　t值　P值SKOV3/CXCR4　2.05±0.16　1.94±0.10　－1.22　0.03 SKOV3/neg　2.89.±0.19　2.89±0.23　－0.22　0.83 SKOV3　2.88±0.82　2.92±0.12　2.90　0.28 F值60.84 P值　＜0.05

2.2荷瘤裸鼠的生存及死亡情況接種SKOV3/CXCR4細胞的裸鼠對照組的平均生存期為(15.0± 0.9)d，CXCR4拮抗劑AMD3100處理組裸鼠平均生存期為(17.50±1.64)d，兩者比較，差異有統計學意義(Z =－2.29，P＜0.05);接種SKOV3/neg細胞的裸鼠對照組的平均生存期為(16.83±1.33)d，CXCR4拮抗劑AMD3100處理組裸鼠平均生存期為(17.00± 0.89)d，兩者比較差異無統計學意義(Z =－0.52，P ＞0.05);接種SKOV3細胞的裸鼠平均生存期為(17.20±1.90)d，CXCR4拮抗劑AMD3100處理的裸鼠平均生存期為(17.17±1.94)d，兩者比較差異無統計學意義(Z =－0.25，P＞0.05); 3種裸鼠對照組的平均生存期比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。見表2。

表2　2組生存時間比較　n =6，d±s

表2　2組生存時間比較　n =6，d±s

類別　對照組　處理組　Z值P值SKOV3/CXCR4　15.00±0.90　17.50±1.64　－2.29　0.02 SKOV3/neg　16.83±1.33　17.00±0.89　－0.52　0.60 SKOV3　17.20±1.90　17.17±1.94　－0.25　0.81 χ2值48.56 P值　＜0.05

2.3荷瘤裸鼠的腹腔移植瘤情況的對比接種SKOV3/CXCR4細胞裸鼠的對照組腹腔移植瘤的平均個數(87.67±1.86)個，平均重量(3.74±0.11)g，CXCR4拮抗劑AMD3100處理組腹腔移植瘤的個數(80.17±4.58)個，平均重量(2.83±0.10)g，兩者相比具有顯著性差異(P＜0.05);接種SKOV3/neg細胞的裸鼠對照組腹腔內移植瘤的平均個數為個數(79.17±2.32)個，平均重量(2.82±0.13)g，CXCR4拮抗劑AMD3100處理組腹腔移植瘤的平均個數(79.83±3.25)個，平均重量(2.76±0.11)g，兩者比較差異無統計學意義(P＞0.05);接種SKOV3/neg細胞的裸鼠對照組腹腔內移植瘤的平均個數(78.16±1.17)個，平均重量(2.82±0.12)g，CXCR4拮抗劑AMD3100處理組腹腔移植瘤的個數(77.67±3.33)個，平均重量(2.84±0.11)g，兩者比較差異無統計學意義(P＞0.05); 3組裸鼠對照組腹腔移植瘤的個數和重量相比差異有統計學意義(P＜0.05); 3組小鼠腹水量比較差異無統計學意義(P＞0.05)。見表3～5。

表3　對照組和處理組腹腔移植瘤的個數比較n =6，個，±s

表3　對照組和處理組腹腔移植瘤的個數比較n =6，個，±s

組別　對照組　處理組　t值　P值SKOV3/CXCR4　87.7±1.9　80.2±4.6　4.04　0.01 SKOV3/neg　79.2±2.3　79.8±3.2　－1.20　0.29 SKOV3　78.2±1.2　77.7±3.3　0.47　0.66 F值48.09 P值　＜0.05

表4　2組腹腔移植瘤的重量比較　n =6，g±s

表4　2組腹腔移植瘤的重量比較　n =6，g±s

組別　對照組　處理組　t值　P值SKOV3/CXCR4　3.74±0.11　2.83±0.10　13.44　0.00 SKOV3/neg　2.82±0.13　2.76±0.11　2.53　0.06 SKOV3　2.82±0.12　2.84±0.11　－0.89　0.42 F值89.03 P值　＜0.05

表5　2組腹水量比較　n =6，ml，±s

組別　對照組　處理組　t值　P值SKOV3/CXCR4　1.20±0.42　1.21±0.40　－0.50　0.64 SKOV3/neg　1.13±0.30　1.15±0.29　－2.08　0.09 SKOV3　1.27±0.38　1.32±0.36　－2.22　0.08 F值0.22 P值　＞0.01

3討論

卵巢癌是女性常見的惡性腫瘤之一，病死率居女性生殖道惡性腫瘤之首。與其他多種類型的癌不同，卵巢癌的主要轉移途徑不是通過血管，而是腹腔轉移，由于在腹腔的廣泛種植和轉移常常引起嚴重腹水和腸梗阻，所以卵巢癌的腹腔轉移是直接引起患者死亡的主要原因。因此深入了解卵巢癌腹腔轉移的機制十分重要。

腹腔微環境是影響卵巢癌轉移方式的重要因素，腹腔微環境中含有許多細胞因子，包括CXCL12及其受體CXCR4、溶血磷脂酸(lysophosphatidic，LPA)及其受體及腹膜間皮細胞等，其中趨化因子CXCL12即基質細胞衍生因子1(strmal cell derived factor-1，SDF-1)，與其趨化因子受體CXCR4在介導惡性腫瘤的浸潤轉移中發揮重要作用。Jiang等［2］首次采用免疫組化的方法分析CXCR4蛋白在正常卵巢表面上皮和卵巢上皮性癌組織的定位表達，發現CXCL12和CXCR4蛋白在卵巢上皮性癌起源的正常卵巢表面上皮無表達，而共表達在卵巢皮質的卵泡細胞。在良性和交界性上皮性卵巢腫瘤中CXCR4蛋白陽性表達率為88%和90%，均為細胞核著色; CXCL12蛋白陽性表達率100%和88%，均為細胞質著色。在卵巢惡性上皮性癌原發灶中癌細胞的CXCR4的陽性率為59%，大多數為細胞質著色; CXCL12蛋白陽性率則為91%。我們前期的體外實驗發現CXCL12單獨作用可促進SKOV3/CXCR4細胞的增殖、遷移及侵襲，這與Scotton等［6，7］報道相一致。

本研究結果顯示3組裸鼠生存時間、腹腔移植瘤的個數和重量比較差異有統計學意義(P＜0.05)，CXCL12濃度越高，受試裸鼠腹腔移植瘤個數越多，重量越大，生存時間越短，而且CXCL12的作用依賴于CXCR4的存在，CXCR4拮抗劑可以控制腫瘤生長，這從體內動物實驗水平進一步說明CXCL12-CXCR4生物軸與卵巢癌的發生發展密切相關。近期，有研究表明高CXCL12的表達的卵巢癌患者較地表達的卵巢癌患者有很低的生存，所以建議高表達的卵巢癌患者應該使用抗CXCL12-CXCR4治療［8］。這與我們的研究一致。同時也有越來越多的關于卵巢上皮癌與CXCL12-CXCR4生物軸關系的實驗在報道［9］，希望CXCL12-CXCR4生物軸對卵巢癌的臨床治療有更多的指導意義。

總之，CXCL12-CXCR4生物軸在實驗水平與卵巢癌的發生、增殖、轉移密切相關，它不僅可作為腫瘤轉移的預測指標及預后因素，而且已成為腫瘤治療的新方向，干擾CXCL12-CXCR4生物軸有可能成為治療卵巢癌的一個有意義的分子靶點。

參考文獻

1 Kijima T，Maulik G，Ma PC，et al.Regulation of cellular proliferarion，cytoskeletal function，and signal transduction through CXCR4 anf c-Kit in small cell lung cancer cells.Cancer Res，2002，62: 6304-6311.

2 Jiang YP，Wu XH，Shi B，et al.Expression of chemokine CXCL12 and its receptor CXCR4 in human epithelial ovarian cancer: an independent prognostic factor for tumor progression.Gynecol Oncol，2006，103: 226-233.

3 郭清，吉向麗，吳小華，等.穩定表達趨化因子受體CXCR4卵巢癌細胞株的建立與鑒定.第四軍醫大學學報，2008，23: 2148-2151.

4 Müller A，Homey B，Soto H，et al.Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis.Nature，2001，410: 50-56.

5 Singh B，Cook KR，Martin C，et al.Evaluation of a CXCR4 antagonist in a xenograft mouse model of inflammatory breast cancer.Clin Exp Metastasis，2010，27: 2333-2340.

6 Scotton CJ，Wilson JL，Milliken D，et al.Epithelial cancer cell migration: a role for chemokine receptors? Cancer Res，2001，61: 4961-4965.

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8 Popple A，Durrant LG，Spendlove I，et al.The chemokine，CXCL12，is an independent predictor of poor survival in ovarian cancer.Br J Cancer，2012，106: 1306-1313.

9 蔣玉萍，吳小華，邢邯英，等.趨化因子CXCL12及其受體CXCR4對卵巢上皮性癌細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響.中華婦產科雜志，2007，42: 403-406.

Experimental study on the correlation between chemokine-CXCL12-CXCR4 and ovarian cancer in nude mice

GUOQing，WU Xiaohua，TAN Lixia，et al.
Department of Obstetrics and Gynecology，The First Hospital of Shijiazhuang City，Shijiazhuang 05001，China

【Abstract】Objective To investigate the correlation between chemokine－CXCL12-CXCR4 and the pathogenesis of ovarian cancer.MethodsThe three kinds of ovarian cancer cells including SKOV3/CXCR4 transfected with plasmid，SKOV3/neg transfected with vector and SKOV3 which was not transfected were cultured in vitro.The 36 nude mice were randomly divided into three groups (12 mice in each group)，and the peritoneal cavity transplanted tumor models in nude mice were established by intraperitoneal injection with the three kinds of ovarian cancer cells.Then the model mice in each group were subdivided into two groups on the second day after ovarian cancer cell inoculation: treatment group (n =6)，control group (n =6).The mice in control group were intraperitoneally injected with 0.9% sodium chloride solution，however，the mice in treatment group were intraperitoneally injected with CXCL12-CXCR4 antagonist－AMD3100.The transplanted tumor number and size in peritoneal cavity，ascites volume and mean survival time were observed after these mice died naturally.Results There were significant differences in body weight differences about 1 week after ovarian cancer cell inoculation between control groups and treatment groups (P＜0.05).There was a significant difference in mean survival time between SKOV3/CXCR4 control group and treatment group (CXCR4 antagonist－AMD3100)(Z =－2.29，P＜0.05)，however，there was no significant difference in mean survival time between SKOV3/neg control group and treatment group (P＞0.05)，nor was between SKOV3 control group and treatment group (P＞0.05).There were significant differences in transplanted tumor mean number and weight in peritoneal cavity between SKOV3/CXCR4 control group and treatment group (P＜0.05).Conclusion There is a correlation between chemokine-CXCL12-CXCR4 and pathogenesis of ovarian cancer，which may be one of main reasons in the pathogenesis of ovarian cancer，and may also reflect the degree of pathogenetic condition to some extent.

【Key words】CXCL12; CXCR4; ovarian tumor

(收稿日期:2013－07－18)

通訊作者:吳小華，050082中國人民解放軍白求恩國際和平醫院婦產科;

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.06.001

【文章編號】1002－7386(2015)06－0805－03

【文獻標識碼】A

【中圖分類號】R 737.31