緩激肽后處理缺血再灌注損傷大鼠心肌磷酸化STAT3、梗死面積及細胞凋亡指數觀察

夏大川，田軼魁，魏民新(天津市第一中心醫院，天津3009；天津醫科大學總醫院)

?

緩激肽后處理缺血再灌注損傷大鼠心肌磷酸化STAT3、梗死面積及細胞凋亡指數觀察

夏大川1，田軼魁2，魏民新2(1天津市第一中心醫院，天津300192；2天津醫科大學總醫院)

摘要：目的觀察緩激肽后處理缺血再灌注損傷大鼠心肌磷酸化STAT3、梗死面積、細胞凋亡指數變化。方法將72只健康雄性Wistar大鼠隨機分為4組各18只，假手術組只穿線，不結扎；缺血再灌注(I-R)組缺血30 min，再灌注120 min。緩激肽后處理(BK)組缺血30 min，再灌注120 min，并于再灌注前予緩激肽(200 μg/kg)。BK +AG490組缺血30 min，再灌注120 min，再灌注前予緩激肽(200 μg/kg)，并于再灌注前5 min靜注AG490(3 mg/kg)。再灌注10 min時各組取6只大鼠處死，制作心肌標本，Western blotting法檢測心肌磷酸化STAT3(p-STAT3)。再灌注120 min時將剩余大鼠處死，制作心肌標本，TTC染色法檢測心肌梗死面積，TUNEL法計算心肌細胞凋亡指數。結果I-R組、BK組、BK+AG490組心肌p-STAT3相對表達量分別為0.28±0.04、0.56±0.08、0.27±0.05，心肌梗死面積分別為38.0%±3.0%、17.3%±2.8%、37.7%±3.8%，心肌細胞凋亡指數分別為72.0%±3.7%、40.7%±3.7%、71.7%±5.9%，BK組與I-R組、BK+AG490組比較，P均<0.01。結論 緩激肽后處理的缺血再灌注損傷大鼠心肌磷酸化STAT3水平升高，心肌細胞凋亡指數降低，心肌梗死面積減少。

關鍵詞：缺血再灌注損傷；緩激肽；磷酸化細胞信號傳導與轉錄活化因子3

研究[1，2]表明，緩激肽后處理可模擬缺血后處理發揮心肌保護作用，且可減少對主動脈的操作，減少并發癥。JAK-STAT通路的主要作用是將細胞外信號傳遞到細胞核，進而調節細胞核內轉錄引發生物學效應[3]，在心肌缺血再灌注損傷及內源性心肌保護機制中發揮重要作用[4，5]。而緩激肽后處理是否可以通過激活JAK2-STAT3通路發揮心肌保護作用目前并不清楚。2013年10月，我們通過構建心肌缺血再灌注損傷模型，觀察了緩激肽后處理缺血再灌注損傷大鼠心肌磷酸化STAT3、梗死面積、細胞凋亡指數變化。現將結果報告如下。

1材料與方法

1.1實驗動物及試劑健康雄性Wistar大鼠72只(體質量230～280 g)，購自解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心。緩激肽、JAK2的特異性拮抗劑AG490購自Sigma公司。TTC試劑及Western blotting檢測用β-actin、p-STAT3及t-STAT3一抗購自Cell Signaling Technology公司，二抗購自北京中杉金橋公司。TUNEL試劑盒購自羅氏公司。

1.2實驗方法

1.2.1心肌缺血再灌注損傷模型構建、分組及處理大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3 mg/g)麻醉，氣管插管連接小動物呼吸機，氣源為室內空氣，呼吸頻率60次/min，潮氣量13～15 mL。大鼠四肢接心電圖監護電極。左側第四肋間開胸，以6/0無損傷線在左冠狀動脈前降支分支下約3 mm處穿一結扎線，已備結扎。結扎時采用直徑0.2 cm的細塑料管穿過結扎線用止血鉗夾緊。心電圖Ⅱ導聯出現ST段抬高及心肌顏色變為蒼白為結扎成功。模型建立成功后將大鼠隨機分為4組各18只，假手術組只穿線，不結扎；缺血再灌注(I-R)組缺血30 min，再灌注120 min。緩激肽后處理(BK)組缺血30 min，再灌注120 min，并于再灌注前給予緩激肽(200 μg/kg)。緩激肽后處理+AG490 (BK+AG490) 組缺血30 min，再灌注120 min，再灌注前給予緩激肽(200 μg/kg)，并于再灌注前5 min靜脈注射AG490(3 mg/kg)。再灌注10 min時各組取6只大鼠處死，制作心肌標本，用以檢測心肌磷酸化細胞信號傳導與轉錄活化因子3(p-STAT3)；于再灌注120 min時將剩余大鼠處死，制作心肌標本，用以檢測心肌細胞凋亡指數及心肌梗死面積。

1.2.2心肌p-STAT3檢測大鼠處死后迅速取出心臟，冰生理鹽水沖凈余血，置-80 ℃冰箱快速冷凍。將速凍后的心臟自心尖向心底切成厚2 mm的切片，Western blotting法檢測p-STAT3，以β-actin作為內參。

1.2.3心肌細胞凋亡指數測算心肌標本固定后常規石蠟包埋和切片，用末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT酶)介導的帶熒光的dUTP缺口末端標記法(TUNEL)測算心肌細胞凋亡指數。每張切片隨機取4個高倍鏡視野，計數每個高倍鏡視野下調亡細胞核數和總細胞核數。凋亡指數為100個細胞核中凋亡細胞核的個數。

1.2.4心肌梗死面積測定制作好的心肌切片置于2%TTC溶液37 ℃避光孵育30 min后，生理鹽水沖去游離染料，10%甲醛固定。藍染區為非缺血區，磚紅色區為危險區，灰白色區為梗死區。用計算機圖像分析系統計算左室總面積(LV)、危險區面積(AAR)及梗死面積(Infarct Size)。以AAR/LV表示心肌缺血程度，Infarct size/AAR表示心肌梗死程度。

2結果

I-R組、BK組、BK+AG490組心肌p-STAT3相對表達量分別為0.28±0.04、0.56±0.08、0.27±0.05，心肌細胞凋亡指數分別為72.0%±3.7%、40.7%±3.7%、71.7%±5.9%，心肌梗死面積分別為38.0%±3.0%、17.3%±2.8%、37.7%±3.8%， BK組與I-R組、BK+AG490組比較，P均<0.01。

3討論

細胞凋亡是一種多基因控制的自身程序性細胞死亡，可分為四個階段，第一階段是細胞凋亡信號的產生；第二階段是信號傳導；第三階段是中心控制和效應階段；第四階段是細胞死亡階段。心肌細胞凋亡是心肌缺血再灌注損傷的主要形式之一[6]。缺血再灌注損傷作為凋亡信號，通過影響基因表達，上調再灌注后期凋亡蛋白表達致心肌細胞凋亡。Zhao等[7]研究發現，抑制心肌細胞凋亡可明顯縮小缺血再灌注心肌梗死面積。Stat3轉錄因子是許多細胞因子和生長因子受體中重要的信號分子,它在許多人類的腫瘤細胞中持續激活,具備潛在的致癌能力和抗凋亡能力。Stat3通過705位酪氨酸磷酸化被激活，進而誘導它的二聚化，核定位以及DNA結合功能。STAT3的活性經常通過能識別705位酪氨酸磷酸化的抗體來檢測。

JAK2-STAT3通路是細胞內重要的轉錄調節因子，研究[8]發現，其在缺血預處理第二窗心肌保護機制中具有核心地位。我們前期研究[9]結果顯示，阻斷JAK2-STAT3通路后，缺血后處理減少心肌梗死面積及抗心肌細胞凋亡的作用消失，提示缺血后處理心肌保護作用依賴于JAK2-STAT3通路。

研究[1，2]證實，緩激肽后處理在多種生物模型中均可減輕缺血再灌注損傷，發揮保護作用，PI3K/Akt通路在這種保護機制中具有核心地位。以往關于緩激肽后處理心肌保護作用主要集中于其減少心肌梗死面積，而對于其抗心肌細胞凋亡的研究較少。目前緩激肽后處理抗心肌細胞凋亡的具體機制尚不十分清楚。本研究結果顯示，在活體大鼠心肌缺血再灌注損傷模型中，緩激肽后處理不僅可減少再灌注后心肌梗死面積，而且可顯著抑制再灌注后心肌細胞凋亡。我們使用AG490阻斷JAK2-STAT3通路后，緩激肽后處理抗凋亡作用消失。提示JAK2-STAT3通路參與了緩激肽后處理抗心肌細胞凋亡機制。但緩激肽后處理是否通過JAK2-STAT3通路調控凋亡相關基因表達，上調再灌注后期抗凋亡蛋白，抑制心肌細胞凋亡，還需進一步研究。

綜上所述，緩激肽后處理能減少缺血再灌注損傷大鼠心肌梗死面積，抑制心肌細胞凋亡，發揮心肌保護作用；其機制可能與JAK2-STAT3通路介導有關。

參考文獻：

[1] Bell RM, Yellon DM. Bradykinin limits infarction when administered as an adjunct to reperfusion in mouse heart:the role of PI3K,Akt and eNOS[J]. Mol Cell Cardiol, 2003,35(2):185-193.

[2] Yang XM, Krieg T, Cui L, et al. NECA and bradykinin at reperfusion reduce infarction in rabbit hearts by signaling through PI3K, ERK, and NO[J]. Mol Cell Cardiol, 2004,36(3):411-421.

[3] Darnell JE. STATs and gene regulation[J]. Science, 1997,277(5332):1630-1635.

[4] Smith RM, Suleman N, Lacerda L, et a1. Genetic depletion of cardiac myocyte STAT-3 abolishes classical preconditioning[J]. Cardiovasc Res, 2004,63(4):611-616.

[5] Boengler K, Buechert A, Heinen Y, et a1. Cardioprotection by ischemic postconditioning is lost in aged and STAT3-deficient mice[J]. Circ Res, 2008,102(1)：131-135.

[6] Eefting F, Rensing B, Wigman J, et al. Role of apoptosis in reperfusion injury[J]. Cardiovasc Res, 2004,61(3):414-426.

[7] Zhao ZQ, Nakamura M, Wang NP, et al. Progressively developed myocardial apoptotic cell death during late phase of reperfusion[J]. Apoptosis, 2001,6(4):279-290.

[8] Barry SP, Townsend PA, Latchman DS, et al. Role of the JAK-STAT pathway in myocardial injury[J]. Trends Mol Med, 2007,13(2):82-89.

[9] 夏大川,田軼魁,吳志浩,等.JAK2-STAT3通路介導缺血后處理心肌保護作用的初步研究[J].天津醫藥,2010,38(1):43-45.

(收稿日期：2014-02-20)

通信作者：魏民新

中圖分類號：R542.2

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2015)03-0029-02

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.03.010