冬凌草膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

劉亞楠

(河南省食品藥品檢驗(yàn)所，河南 鄭州 450003)

冬凌草膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

劉亞楠

(河南省食品藥品檢驗(yàn)所，河南 鄭州 450003)

目的：建立冬凌草膠囊的薄層色譜鑒別和高效液相含量測(cè)定方法。方法：采用薄層色譜法，分別以迷迭香酸對(duì)照品和冬凌草對(duì)照藥材為對(duì)照，對(duì)冬凌草膠囊進(jìn)行定性鑒別；采用HPLC法測(cè)定迷迭香酸的含量，色譜柱Phenomenex-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-2 mL/L磷酸溶液(22∶78)，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)329 nm，柱溫40 ℃。結(jié)果：薄層色譜鑒別方法斑點(diǎn)清晰，重現(xiàn)性好；迷迭香酸進(jìn)樣量在23.87～596.75 ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r=0.999 97，平均回收率100.8%，RSD為2.2%(n=6)。結(jié)論：本方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，能有效控制冬凌草膠囊的質(zhì)量。

冬凌草膠囊；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；迷迭香酸；薄層色譜法；高效液相法

冬凌草膠囊是由冬凌草經(jīng)過(guò)乙醇16 h提取制成的單方制劑，具有清熱解毒的作用，用于急、慢性扁桃體炎，咽炎，喉炎及口腔炎。冬凌草膠囊現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)，檢驗(yàn)項(xiàng)目設(shè)置簡(jiǎn)單，專屬性差，不能滿足藥品質(zhì)量控制需要。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，冬凌草中的主要有效成分為二萜類化合物冬凌草甲素、冬凌草乙素，三萜類化合物熊果酸、齊敦果酸，有機(jī)酸類化合物迷迭香酸等[1]。筆者根據(jù)國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)提高工作要求，對(duì)冬凌草膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究與提高；增加冬凌草對(duì)照藥材和迷迭香酸對(duì)照品的薄層色譜鑒別，以及迷迭香酸含量測(cè)定，以更好地控制冬凌草膠囊的質(zhì)量。

1 藥品、試劑與儀器

冬凌草膠囊來(lái)自安陽(yáng)中智藥業(yè)有限責(zé)任公司(批號(hào)111201，110801，121201，100601，100602，100401)、河南興源制藥有限公司(批號(hào)1003280，1001280)、安陽(yáng)市華安藥業(yè)有限責(zé)任公司(批號(hào)121107)。對(duì)照品迷迭香酸(供含量測(cè)定用，批號(hào)111871-201203)、對(duì)照藥材冬凌草(批號(hào)121325-200301)均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定研究院；試驗(yàn)中所用試劑，除乙腈為Merk.公司色譜純外，其他試劑均為分析純；薄層板、硅膠G板，分別購(gòu)自煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所和青島海洋化工廠。Waters 2690高效液相色譜儀，Waters 996二極管陣列檢測(cè)器，美國(guó)Waters公司產(chǎn)品。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC鑒別

2.1.1 供試品溶液的制備

取本品0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入500 mL/L甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，取出，放冷，用500 mL/L甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備

取冬凌草對(duì)照藥材1 g，加甲醇30 mL，超聲處理30 min，放冷，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。取迷迭香酸對(duì)照品，加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.1.3 薄層色譜條件

硅膠G為吸附劑，點(diǎn)樣量5 μL，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸 (6∶4∶1)為展開劑，展開，晾干，噴以50 mL/L三氯化鋁乙醇溶液，置紫外光燈(365 nm)下檢視。樣品色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。見(jiàn)圖1。

圖1 TLC圖譜

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件

色譜柱為Phenomenex-C18柱(4.6 mm ×250 mm，5μm)，流動(dòng)相為乙腈-2 mL/L磷酸溶液(22∶78)；流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)329 nm，柱溫40 ℃。理論板數(shù)迷迭香酸峰計(jì)算應(yīng)不低于4 000。

2.2.2 溶液的制備

對(duì)照品溶液的制備：取迷迭香酸對(duì)照品適量，精密稱定，加500 mL/L甲醇制成每毫升含60 μg的溶液，即得。

供試品溶液的制備：取本品內(nèi)容物0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入500 mL/L甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，取出，放冷，用500 mL/L甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

分別精密吸取對(duì)照品溶液及供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，色譜圖見(jiàn)圖2。

A.對(duì)照品溶液; B.供試品溶液圖2 HPLC色譜圖

2.2.3 線性關(guān)系考察

取迷迭香酸對(duì)照品溶液(23.87 mg/L)，分別吸取1，2，5，10，15，20，25 μL，注入液相色譜儀，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析，得回歸方程Y=3 060.56X+5 780.065，r=0.999 97。結(jié)果表明：迷迭香酸進(jìn)樣量在23.87～596.75 ng 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一對(duì)照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果:迷迭香酸面積的RSD值為0.4%(n=6)。

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)樣品，按照2.2.2項(xiàng)下方法操作制得樣品溶液，取10 μL注入液相色譜儀，測(cè)得平均含量為5.048 6 mg/g，RSD值為1.5%(n=6)。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別在0,2,4,6,8,10 h進(jìn)樣10 μL，測(cè)定迷迭香酸峰面積。結(jié)果：RSD值為0.2%，表明樣品在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品(批號(hào)100602，含量為5.0486 mg/g)6份，每份0.25 g，精密加入迷迭香酸對(duì)照品甲醇溶液(23.87 mg/L)50 mL，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定迷迭香酸的含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2.8 耐用性試驗(yàn)

取按2.2.2項(xiàng)下的方法制備的同一供試品溶液，分別用3種不同品牌的C18色譜柱測(cè)定其含量。結(jié)果表明:該方法對(duì)不同色譜柱耐用性良好。

表2 不同商品規(guī)格的色譜柱耐用性試驗(yàn)

2.2.9 樣品測(cè)定

按照2.2.2項(xiàng)下的操作方法，制備9批冬凌草膠囊樣品的供試品溶液，分別精密吸取對(duì)照品溶液及供試品溶液各5～10 μL注入液相色譜儀，按照2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 9批樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討 論

目前，從冬凌草中已分離出多種二萜、三萜類化合物、甾體、黃酮、生物堿、揮發(fā)油、氨基酸、有機(jī)酸等成分[1]，其中熊果酸及齊墩果酸存在廣泛，專屬性較差。迷迭香酸具有較好的抗菌、消炎、止痛的功效，易溶于甲醇、熱水，有較好的穩(wěn)定性和專屬性[2-3]。因此，本實(shí)驗(yàn)將迷迭香酸作為定量控制的指標(biāo)成分。研究表明：所建立的方法操作簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性好，分析快速準(zhǔn)確。

薄層色譜試驗(yàn)中曾選用二甲苯-乙酸乙酯-甲酸、三氯甲烷-甲醇-甲酸、二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸等展開系統(tǒng)為展開劑，結(jié)果以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸 (6∶4∶1)展開系統(tǒng)分離效果最佳，Rf值適中，斑點(diǎn)清晰，重現(xiàn)性高。

HPLC試驗(yàn)中，樣品提取采用3因素3水平正交試驗(yàn)法，分別以水、500 mL/L甲醇、甲醇3種不同提取溶劑，采用超聲、加熱回流2種方法提取0.5 h、1 h、2 h，通過(guò)對(duì)9個(gè)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行直觀分析和方差分析、綜合評(píng)價(jià)，結(jié)果以500 mL/L甲醇50 mL加熱回流1 h提取效率最高，故采用此法制備供試品溶液。

二萜類成分冬凌草甲素是冬凌草中較好的專屬性成分，但本研究收集到的9批冬凌草膠囊樣品僅有2批樣品檢出極微量的冬凌草甲素，暫不適合作為質(zhì)控指標(biāo)。經(jīng)過(guò)生產(chǎn)企業(yè)工藝研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)達(dá)16 h的加壓回流，冬凌草甲素?fù)p失嚴(yán)重。隨著現(xiàn)代制藥設(shè)備進(jìn)步，提取效率大大提高，建議修改冬凌草膠囊生產(chǎn)工藝，縮短提取時(shí)間，使之既能節(jié)約能源，又能提高冬凌草甲素的含量。

[1]馮衛(wèi)生，李紅偉，鄭曉珂，等.冬凌草化學(xué)成分進(jìn)展[J].中國(guó)新藥雜志，2008，17(23):2003.

[2]李偉光，梁敬鈺.迷迭香酸的研究進(jìn)展[J].海峽藥學(xué)，2004，16(1):1.

[3]林瑞超，馬雙成.中藥化學(xué)對(duì)照品應(yīng)用手冊(cè)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2013：387.

(編輯 陶 珠)

1001-6910(2015)07-0059-03 ·藥學(xué)研究·

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10.3969/j.issn.1001-6910.2015.07.29

2009國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)提高行動(dòng)計(jì)劃項(xiàng)目(206)

2015-02-04；

2015-04-22