mM-CSF及其剪切體對淋巴細胞白血病Ramos細胞增殖的抑制作用

馬翠花，種靖慧，廖金鳳，林永敏，衛(wèi)佳，鄭國光(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所血液病醫(yī)院，天津300020;2秦皇島市第一醫(yī)院)

mM-CSF及其剪切體對淋巴細胞白血病Ramos細胞增殖的抑制作用

馬翠花1，2，種靖慧1，廖金鳳1，林永敏1，衛(wèi)佳1，鄭國光1
(1中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所血液病醫(yī)院，天津300020;2秦皇島市第一醫(yī)院)

摘要:目的探討膜結(jié)合型巨噬細胞集落刺激因子(mM-CSF)及其剪切體(mM-CSF-Δ)對淋巴細胞白血病Ramos細胞增殖的抑制作用。方法采用Overlap PCR法構(gòu)建帶有mM-CSF的真核表達質(zhì)粒pTARGET-mM-CSF，再進一步構(gòu)建胞內(nèi)區(qū)截短30個氨基酸的表達質(zhì)粒pTARGET-mM-CSF-Δ，并進行PCR及DNA雙向測序鑒定。將空載體pTARGET、pTARGET-mM-CSF、pTARGET-mM-CSF-Δ質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染Ramos細胞，經(jīng)G418篩選穩(wěn)定表達細胞株，并用RT-PCR、Western blotting進行鑒定; MTT法檢測細胞增殖，流式細胞儀檢測細胞周期。結(jié)果成功構(gòu)建了mM-CSF和mM-CSF-Δ的真核表達載體，獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株Ramos-V、Ramos-M和Ramos-Δ。Ramos-M、Ramos-Δ、Ramos-V細胞增殖能力的OD值分別為0.413±0.014、0.384±0.019、0.463±0.037，Ramos-M細胞與Ramos-Δ細胞比較，Ramos-M、Ramos-Δ細胞分別與Ramos-V細胞比較，P＜0.05或＜0.01。Ramos-M、Ramos-Δ、Ramos-V細胞處于G0/G1期的比例分別為41.54%±1.22%、45.60%±1.09%、39.20%±1.53%，Ramos-M細胞與Ramos-Δ細胞比較，Ramos-M、Ramos-Δ細胞分別與Ramos-V細胞比較，P＜0.05或＜0.01。結(jié)論mM-CSF、mM-CSF-Δ均能抑制淋巴細胞白血病Ramos細胞增殖，且后者抑制作用更強。

關(guān)鍵詞:白血病; Ramos細胞;巨噬細胞集落刺激因子;膜結(jié)合型巨噬細胞集落刺激因子;剪切體;細胞增殖;細胞周期

細胞因子是傳遞細胞間通信的重要載體之一，其表達、定位發(fā)生改變會引起細胞間信號的異常傳遞。除了經(jīng)典的可溶性形式，許多細胞因子如TGF-α、干細胞因子等，還以膜結(jié)合形式存在，并與其受體通過并置性作用機制參與鄰近細胞之間的細胞通信［1］。巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)經(jīng)選擇性剪接可產(chǎn)生3種異構(gòu)體，即膜結(jié)合型CSF (mM-CSF)、分泌型CSF(sM-CSF)和基質(zhì)型CSF (PG-M-CSF)［2］。mM-CSF作為膜結(jié)合型細胞因子，其異常表達與血液腫瘤細胞的關(guān)系備受關(guān)注。本研究旨在探討mM-CSF對淋巴細胞白血病Ramos細胞增殖的影響及其機制。

1　材料與方法

1.1主要試劑RPMI1640培養(yǎng)基購自Gibco公司，TRIzol、MML-V試劑和LipofectamineTM2000均購自美國Invitrogen公司。Ex Taq DNA聚合酶、T4DNA連接酶、PyrobestTMDNA聚合酶、質(zhì)粒提取和膠回收試劑盒均購自TaKaRa公司，PCR擴增引物的合成與DNA測序均由上海生工公司完成，Anti-MCSF抗體購自R＆D公司，Super-Signal West Pico化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國Pierce公司，G418和MTT購自Sigma公司。

1.2pTARGET-mM-CSF和pTARGET-mM-CSF-Δ真核表達載體的構(gòu)建用Overlap PCR方法獲得mM-CSF序列。以含有M-CSF基因的pCDNA3.0質(zhì)粒(購自Santa公司)為模板，分別擴增、純化出mMCSF的兩段編碼序列mM-CSF1(Forward為5'-ACCGCTCGAGGCCCGTATGACCGCGCCG-3'，Reverse為5'-CTCATGGCCTTGGCTGGA-3';片段大小543 bp)和mM-CSF2(Forward為5'-TCCAGCCAAGGCCATGAG-3'，Reverse為5'-ACGGGGTACCCTACACTGGCAGTTCCACC-3';片段大小228 bp)，然后以它們的混合物為模板用mM-CSF的克隆引物(Forward為5'-ACCGCTCGAGGCCCGTATGACCGCGCCG-3'，Reverse為5'-ACGGGGTACCCTACACTGGCAGTTCCACC-3';片段大小771 bp)擴增出完整的mM-CSF序列。再以mM-CSF序列為模板，應(yīng)用mM-CSF-Δ的克隆引物(Forward為5'-ACCGCTCGAGGCCCGTATGACCGCGCCG-3'，Reverse為5'-ACGGGGTACCCTAGCTCCTCCGCCTCCACC-3';片段大小681 bp)擴增胞內(nèi)區(qū)編碼30個氨基酸的基因片段獲得mM-CSF-Δ序列。以上PCR反應(yīng)步驟均如下:用高保真PyrobestTMDNA聚合酶進行PCR;94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，55℃退火40 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)后72℃7 min結(jié)束反應(yīng)。分別膠回收帶有mM-CSF和mM-CSF-Δ序列的PCR產(chǎn)物，經(jīng)XhoⅠ和KpnⅠ雙酶切并與pTARGET載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli DH5α，篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，進行PCR鑒定及DNA雙向測序鑒定。PCR鑒定插入片段大小正確(圖1)，DNA測序正確。

1.3細胞轉(zhuǎn)染、篩選及鑒定Ramos細胞(由本室保存)用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養(yǎng)液在37℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)。選取對數(shù)生長期細胞進行實驗。24孔板每孔接種5×105個Ramos細胞，懸于500 μL無抗生素、含10% FBS的1640培養(yǎng)液，按照LipofectamineTM2000說明書進行操作，將空載體pTARGET、pTARGET-mM-CSF、pTARGET-mMCSF-Δ質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染Ramos細胞，分別命名為Ramos-V、Ramos-M和Ramos-Δ細胞。轉(zhuǎn)染后48 h，加入1 400 μg/mL G418進行篩選，每2 d換液1次，篩選后的第14天將細胞轉(zhuǎn)移至25 mL的培養(yǎng)瓶。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株采用RT-PCR和Western blotting進行鑒定。收集Ramos-V、Ramos-M和Ramos-Δ細胞，用RT-PCR檢測mM-CSF、mM-CSF-Δ(mM-CSF鑒定引物Forward為5'-GCGCTTCAGAGATAACACC-3'，Reverse為5'-CCTCCGCCTCCACCTGTAGA-3';片段大小382 bp)和質(zhì)粒自身的Neo基因(Forward為5'-GGTGGAGAGGCTATTCGGCT-3'，Reverse為5'-GATAGAAGGCGATGCGCTGC-3';片段大小728 bp)。按產(chǎn)品說明書，用TRIzol提取細胞總RNA，并用MML-V反轉(zhuǎn)錄酶將1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以甘油醛三磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參(Forward為5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，Reverse為5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3';片段大小226 bp)，取2 μL進行PCR，進行25個循環(huán)，具體反應(yīng)條件同1.2，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳。收集Ramos-V、Ramos-M和Ramos-Δ細胞各5×106個，分別加入裂解液提取總蛋白。樣品經(jīng)10% SDS-PAGE分離后，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶4℃封閉過夜，1∶200稀釋M-CSF抗體室溫孵育2 h，洗膜后1∶2 000稀釋二抗室溫孵育1 h，最后暗室中以化學(xué)發(fā)光法顯色，X線片曝光。RT-PCR在上述細胞株均能檢測出質(zhì)粒所帶Neo基因; mM-CSF和mM-CSF-Δ分別表達于Ramos-M和Ramos-Δ細胞中(圖2)。Western blotting從蛋白水平檢測發(fā)現(xiàn)mM-CSF和mM-CSF-Δ在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞中表達(圖3)。

1.4細胞增殖檢測采用MTT法。收集并計數(shù)細胞，分別用含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)液將細胞調(diào)整為1×105/mL，以每孔180 μL接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)44 h后加入20 μL MTT(5 mg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心后除去上清加入150 μL DMSO振蕩10 min后使用酶標(biāo)儀檢測每孔于546 nm波長處的光密度(OD)值，實驗結(jié)果取5孔的均值。

1.5細胞周期檢測收集并計數(shù)已培養(yǎng)48 h的Ramos-V、Ramos-M和Ramos-Δ細胞各1×106cells，PBS洗1次，70%乙醇4℃固定24 h，離心棄上清，加RNaseA 5 μL(10 μg/μL)，室溫孵育15 min后加200 μL PI，避光室溫孵育30 min，流式細胞術(shù)檢測細胞周期。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計量資料以珋x±s表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

Ramos-M、Ramos-Δ、Ramos-V細胞增殖能力的OD值分別為0.413±0.014、0.384±0.019、0.463 ±0.037，Ramos-M細胞與Ramos-Δ細胞比較，Ramos-M、Ramos-Δ細胞分別與Ramos-V細胞比較，P＜0.05或＜0.01。Ramos-M、Ramos-Δ、Ramos-V細胞處于G0/G1期的比例分別為41.54%±1.22%、45.60%±1.09%、39.20%±1.53%，Ramos-M細胞與Ramos-Δ細胞比較，Ramos-M、Ramos-Δ細胞分別與Ramos-V細胞比較，P＜0.05或＜0.01。

3　討論

M-CSF又稱集落刺激因子1(CSF-1)，經(jīng)選擇性剪接形成的3種異構(gòu)體均是c-fms原癌基因編碼跨膜糖蛋白M-CSF受體的配體［3］。其中，sM-CSF前體含外顯子編碼的蛋白酶切位點，可以被蛋白酶切釋放sM-CSF;但人mM-CSF前體分子缺乏相應(yīng)的蛋白酶切位點而形成膜結(jié)合的形式［2］。M-CSF被認(rèn)為是一個多功能的細胞因子，不僅在造血系統(tǒng)中擔(dān)負著調(diào)節(jié)單核/巨噬細胞增殖、分化等功能，而且還在婦科腫瘤、骨代謝、炎癥反應(yīng)、甲狀腺癌、前列腺癌及一些中樞系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用［4～6］。

巨噬細胞是一種重要的免疫細胞，在不同的微環(huán)境被多種細胞因子或趨化因子活化形成不同的表型［7，8］，在腫瘤發(fā)展過程中充當(dāng)一把“雙刃劍”。直腸癌微環(huán)境中的腫瘤相關(guān)巨噬細胞(TAM)通過分泌TNF-α、IL-6來增強腫瘤細胞的浸潤、轉(zhuǎn)移能力，促進腫瘤的進展［9］。研究［10］報道，TAM的分化也能被INF-γ抑制，降低膽囊癌中VEGF的濃度，減少膽囊癌血管產(chǎn)生，從而抑制膽囊癌的進展。mM-CSF作為細胞因子中的一員，對巨噬細胞功能極化的影響是腫瘤發(fā)展進程的關(guān)鍵。在肝癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤及乳腺癌中均發(fā)現(xiàn)，表達mM-CSF的腫瘤細胞能夠引起巨噬細胞的抗腫瘤免疫效應(yīng)［11～13］;而mM-CSF與其受體介導(dǎo)的并置性刺激作用卻可促進血液惡性細胞增殖［1］，而且它可以通過異常活化巨噬細胞對血液系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)展起促進作用［14］。mM-CSF在不同微環(huán)境中發(fā)揮不同作用，其機制越來越受到關(guān)注。

本文在不表達M-CSF受體的Ramos細胞中分別構(gòu)建了穩(wěn)定表達mM-CSF及胞內(nèi)區(qū)截短30個氨基酸的mM-CSF(mM-CSF-Δ)細胞株，mM-CSF、mMCSF-Δ均能抑制淋巴細胞白血病Ramos細胞增殖，且后者抑制作用更強。可見，mM-CSF胞外區(qū)抑制Ramos細胞增殖作用更明顯，這為進一步深入研究mM-CSF在惡性腫瘤中的作用機制奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻:

［1］王大剛，鄭國光，種靖慧，等.膜結(jié)合型干細胞因子促進白血病細胞K562的增殖和集落形成［J］.中國腫瘤生物治療雜志，2009，16(1) : 6-11.

［2］Cerretti DP，Wignall J，Anderson D.Human macrophage-colony stimulating factor: alternative RNA and protein processing from a single gene［J］.Mol Immunol，1988，25(8) : 761-770.

［3］Sherr CJ，Rettenmier CW，Sacca R，et al.The c-fms proto-oncogene product is related to the receptor for the mononuclear phagocyte growth factor，CSF-1［J］.Cell，1985，41(3) : 665-676.

［4］Aharinejad S，Salama M，Paulus P，et al.Elevated CSF1 serum concentration predicts poor overall survival in women with early breast cancer［J］.Endocr Relat Cancer，2013，20(6) : 777-783.

［5］Ryder M，Gild M，Hohl TM，et al.Genetic and pharmacological targeting of CSF-1/CSF-1R inhibits tumor-associated macrophages and impairs BRAF-induced thyroid cancer progression［J］.PLoS One，2013，8(1) : e54302.

［6］Xu J，Escamilla J，Mok S，et al.CSF1R signaling blockade stanches tumor-infiltrating myeloid cells and improves the efficacy of radiotherapy in prostate cancer［J］.Cancer Res，2013，73 (9) : 2782-2794.

［7］Ruffell B，Affara NI，Coussens LM.Differential macrophage programming in the tumor microenvironment［J］.Trends Immunol， 2012，33(3) : 119-126.

［8］De Palma M，Lewis CE.Macrophage regulation of tumor responses to anticancer therapies［J］.Cancer Cell，2013，23(3) : 277-286.

［9］張銀旭，張俊華，劉宇，等.直腸癌中腫瘤相關(guān)巨噬細胞、炎性因子的表達變化及意義［J］.山東醫(yī)藥，2011，51(18) : 97-98.

［10］孫濤，張明宇，程穎，等.通過INF-γ影響腫瘤相關(guān)巨噬細胞抑制膽囊癌血管發(fā)生的實驗研究［J］.山東醫(yī)藥，2011，51(48) :25-27.

［11］Dan Q，Sanchez R，Delgado C，et al.Non-immunogenic murine hepatocellular carcinoma Hepa1-6 cells expressing the membrane form of macrophage colony stimulating factor are rejectedin vivo and lead to T-cell immunity against the parental tumor［J］.Mol Ther，2001，4(5) : 427-437.

［12］Jadus MR，Chen Y，Boldaji MT，et al.Human U251MG glioma cells expressing the membrane form of macrophage colony-stimulating factor (mM-CSF) are killed by human monocytes in vitro and are rejected within immunodeficient mice via paraptosis that is associated with increased expression of three different heat shock proteins［J］.Cancer Gene Therapy，2003，10(5) : 411-420.

［13］Williams CC，Trinh H，Tran TV，et al.Membrane macrophage colony-stimulating factor on MADB106 breast cancer cells does not activate cytotoxic macrophages but immunizes rats against breast cancer［J］.Mol Ther，2001，3(2) : 216-224.

［14］Wang L，Zheng GG，Ma CH，et al.A special linker between macrophage and hematopoietic malignant cells: membrane form of macrophage colony-stimulating factor［J］.Cancer Res，2008，68(14) : 5639-5647.

Inhibitory effect of mM-CSF and its spliceosome on proliferation of lymphocytic leukemia cell line Ramos

MA Cui-hua1，CHONG Jing-hui，LIAO Jin-feng，LIN Yong-min，WEI Jia，ZHENG Guo-guang
(1 Institute of Hematology＆Blood Diseases Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences，Tianjin 300020，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the inhibitory effect of membrane-bound macrophage colony-stimulating factor (mM-CSF) and its spliceosome (mM-CSF-Δ) on proliferation of lymphocytic leukemia cell line Ramos.Methods The eukaryotic expression plasmid of pTARGET-mM-CSF with mM-CSF was constructed with Overlap PCR，and then pTARGET-mM-CSF-Δ of 30 amino acide located in the intracellular region of brachytmema mutation was obtained; and meanwhile，they were identified by PCR and DNA sequencing.The empty vector pTARGET，pTARGET-mM-CSF and pTARGET-mM-CSF-Δ plasmid were transfected into Ramos cells，the cell line with stable expression was screened by G418 and was detected by RT-PCR and Western blotting.Proliferation and cell cycle of these stably transfected cells were detected by MTT and flow cytometry.Results The mM-CSF and mM-CSF-Δ eukaryotic expression vectors were successfully constructed.The stable transfectants Ramos-V，Ramos-M and Ramos-Δ were obtained.The OD of proliferation ability of Ramos-M，Ramos-Δ and Ramos-V were 0.413±0.014，0.384±0.019 and 0.463±0.037，respectively.Significant difference was found between the cell lines of Ramos-M and Ramos-Δ，among the cell lines of Ramos-M，Ramos-Δ and Ramos-V，respectively (P＜0.05 or P＜0.01).The proportion of G0/G1phases of Ramos-M，Ramos-Δ and Ramos-V cells were 41.54%±1.22%，45.60%±1.09% and 39.20%±1.53%，respectively.Significant difference was found betweenbook=2,ebook=121Ramos-M and Ramos-Δ cells，among Ramos-M，Ramos-Δ and Ramos-V cells (P＜0.05 or P＜0.01).Conclusion mM-CSF and mM-CSF-Δ may inhibit the proliferation of lymphocytic leukemia cell line Ramos and the inhibitory effect of the latter is stronger.

Key words:leukemia; Ramos cells; macrophage colony-stimulating factor; membrane-bound macrophage colonystimulating factor; spliceosome; cell proliferation; cell cycle

(收稿日期:2015-03-25)

通信作者簡介:鄭國光(1967-)，男，博士，研究員，研究方向為血液細胞生物學(xué)、分子生物學(xué)。E-mail: zhengggtjchn@ aliyun.com

作者簡介:第一馬翠花(1981-)，女，博士，助理研究員，研究方向為分子生物學(xué)。E-mail: michellemch@163.com

基金項目:國家自然科學(xué)基金資助項目(81170511，81370634) ;教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才計劃(NCET-08-0329)。

文章編號:1002-266X(2015)19-0001-04

文獻標(biāo)志碼:A

中圖分類號:R737.33

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.19.001