葉酸偶聯白蛋白納米粒的應用研究進展

趙潔，夏亞丹，劉艷艷(菏澤市牡丹人民醫院，山東菏澤74000;泰安市中心醫院;菏澤醫學專科學校)

葉酸偶聯白蛋白納米粒的應用研究進展

趙潔1，夏亞丹2，劉艷艷3
(1菏澤市牡丹人民醫院，山東菏澤274000;2泰安市中心醫院;3菏澤醫學專科學校)

摘要:葉酸偶聯白蛋白納米粒具有主動靶向性和靶向范圍廣等獨特優點，應用前景廣闊。筆者收集整理了葉酸偶聯白蛋白納米粒的相關國內外文獻，現對其作為靶向藥物載體的制備方法、靶向性、載藥方式及其應用作一綜述。

關鍵詞:葉酸;白蛋白納米粒;葉酸受體;藥物載體;腫瘤;主動靶向性

傳統的抗腫瘤藥物缺乏靶向性，不良反應多［1］。近年來腫瘤的靶向給藥體系為研究熱點［2］。自2005年美國FDA批準白蛋白結合紫杉醇納米粒注射混懸液上市以后，白蛋白納米粒作為靶向藥物載體引起臨床關注。白蛋白納米粒載藥系統具有靶向、緩釋，生物利用度高，減少用藥過程中的不良反應等優點，其在體內主要輸送到單核巨噬系統(RES系統)，具有器官被動靶向性，這對局限于RES系統的惡性腫瘤(如肝癌、骨髓瘤)的化療具有重要意義［3］。但由于多數疾病不在RES系統中，提高白蛋白納米粒在體內的靶向性，成為研究人員面臨的重要問題［4］。葉酸是一種低分子量維生素，葉酸受體常在人癌細胞過表達，而在大多數正常組織中的表達高度限制［5］。葉酸受體作為一種腫瘤標記物，可用來實現抗腫瘤藥物的靶向輸送［6］。針對葉酸受體的特性以及白蛋白納米技術在藥物載體上的應用，研究人員設計出葉酸偶聯白蛋白納米粒作為主動靶向于腫瘤細胞的藥物載體。本文綜述了近年來葉酸偶聯白蛋白納米粒的研究概況，包括制備方法、靶向性、載藥方式及其應用。

1　葉酸偶聯白蛋白納米粒的制備方法

白蛋白表面活性氨基(暴露于白蛋白納米粒表面的賴氨酸—氨基及末端氨基)是進行化學修飾的有效連接部位，可與葉酸發生偶聯反應。文獻報道的葉酸偶聯白蛋白納米粒的制備方法主要是首先制備出白蛋白納米粒(采用去溶劑化等方法制備)和葉酸活性酯(利用二環己基碳二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺、碳二亞胺與葉酸反應制備)，然后于堿性緩沖液中用葉酸活性酯與白蛋白表面氨基偶聯制備葉酸偶聯牛血清白蛋白納米粒(葉酸-BSANPs)。產物可利用葡聚糖凝膠柱或超速離心等方法進行分離。葉酸偶聯率常用2，4，6-三硝基苯磺酸顯色法測定。白蛋白納米粒徑及其表面殘余氨基的量是影響葉酸偶聯的重要因素。Zu等［7］采用響應面分析法研究牛血清白蛋白(BSA)濃度、乙醇滴加速率、乙醇與水的比例以及交聯度對牛血清白蛋白納米粒(BSANPs)粒徑大小及其表面殘余氨基的數量的影響。結果表明，影響納米粒徑的主要因素為BSA濃度和乙醇的滴加速率，影響表面殘余氨基的數量的因素主要為BSA濃度、乙醇的滴加速率與交聯度。

目前文獻報道的與葉酸偶聯的白蛋白納米粒主要是牛血清白蛋白(BSA)和人血清白蛋白(HSA)。如張良坷等［8］在pH=9.0的碳酸鹽緩沖液中，使BSANPs表明氨基與葉酸活性酯偶聯，首次制備葉酸-BSANPs，直徑約70 nm，葉酸偶聯率為28.3%。陳道楨等［9］報道了葉酸偶聯人血清白蛋白納米粒(葉酸-HSANPs)的制備方法:將葉酸溶于pH=9.0 的PBS，加入EDC活化，加入含人血清白蛋白納米粒(HASNPs)的PBS，攪拌使其反應。采用葡聚糖凝膠柱對反應液進行分離，收集淡黃色有乳光部分，葉酸偶聯率為27.26%。

2　葉酸偶聯白蛋白納米粒載體的靶向性

葉酸偶聯白蛋白納米粒具有白蛋白納米粒的被動靶向性及葉酸—葉酸受體介導的主動靶向性的雙重優勢，使葉酸偶聯白蛋白納米粒的靶向性增強。另外，研究發現在卵巢癌、子宮頸癌、肺癌、乳腺癌、結腸癌、直腸癌和腎細胞癌等多種腫瘤細胞膜表面上的葉酸受體活性和數量顯著高于一般正常細胞，因此葉酸偶聯白蛋白納米粒的腫瘤靶向應用范圍較為廣泛［10］。雖然葉酸受體將葉酸轉運進癌細胞的具體機制尚不清楚，但葉酸偶聯物可以通過葉酸受體介導的內吞作用而被癌細胞攝取［11］。而近年來對于葉酸偶聯白蛋白納米粒的研究也表明該納米粒子可以經過葉酸受體葉酸介導的內吞作用進入葉酸受體表達陽性的腫瘤細胞。

2.1葉酸受體葉酸介導的內吞作用張良坷等［8］研究了葉酸-BSANP對人卵巢癌細胞SKOV3的靶向性。體外實驗表明，SKOV3細胞對葉酸-BSANPs的攝入量高于無葉酸修飾的BSANPs，攝入量隨葉酸-BSANPs濃度的增大和培養時間的延長而增加，并對時間和濃度的增加呈現出飽和性。此外葉酸-BSANPs的攝入會受到游離葉酸的抑制，而表面未修飾葉酸的BSANPs的攝入并不受到葉酸的抑制。該研究結果顯示葉酸偶聯白蛋白納米粒可通過葉酸受體介導進入SKOV3細胞。

2.2主動靶向于多種腫瘤細胞Kreuter等［12］研究顯示葉酸-HSANPs可顯著提高人神經母細胞瘤和鼠腦膠質瘤細胞對納米粒的結合和攝取能力，而對正常人包皮成纖維細胞的攝取能力無影響。這表明葉酸偶聯白蛋白納米粒對多種腫瘤細胞具有主動靶向性。

3　葉酸偶聯白蛋白載體的載藥方式

葉酸偶聯白蛋白納米粒作為藥物的主動靶向性載體，主要以物理結合和化學偶聯兩種方式進行載藥。

3.1物理結合載藥物理結合載藥主要有兩種方式:一種是依賴白蛋白與藥物的相互作用將藥物包埋于葉酸偶聯白蛋白納米顆粒中。文獻報道的大多數葉酸偶聯白蛋白載藥體系采用該方法進行載藥。Zhang等［13］制備的葉酸偶聯白蛋白包載米托蒽醌納米粒(MTO-BSA-葉酸) :將葉酸-BSANPs分散在pH=9碳酸鹽緩沖液或PBS中，加入MTO室溫攪拌，獲得MTO-BSA-葉酸;其粒徑為68 nm，載藥量為9.7%±0.1%，包封率為96.6%±1.0%。另一種方法是先將藥物包埋于白蛋白納米粒中，然后在堿性環境中再與葉酸活性酯偶聯。例如葉酸修飾的白蛋白包載多西紫杉醇(DT)納米粒(葉酸-DT-BSANPs)的制備［14］:首先用去溶劑化法制備DTBSANPs，然后在pH=9碳酸鹽緩沖液中與葉酸活性酯偶聯制備葉酸-DT-BSA-NPs。粒徑小于220 nm，藥物包封率為45%±8%，載藥量為14%±0.6%。

葉酸偶聯白蛋白納米粒不僅可以包載單一藥物，還可以同時包載多種藥物，例如同時包載卡鉑和紫杉醇的葉酸—卡鉑—紫杉醇白蛋白納米靶向制劑［15］。制備方法:在含有BSA和卡鉑的緩沖溶液中滴加紫杉醇乙醇溶液，制備出卡鉑—紫杉醇—白蛋白納米粒，然后與葉酸活性酯反應制備產物。粒徑為199.4 nm，卡鉑和紫杉醇包封率分別為91.4% 和56.1%，總載藥量為21.0%。體外釋放結果表明該納米粒中紫杉醇溶出速率增加，卡鉑具有緩釋效果。

3.2化學偶聯載藥利用藥物與白蛋白載體之間產生分子間化學連接形成葉酸偶聯白蛋白藥物。例如葉酸偶聯白蛋白負載阿霉素(葉酸-BSA-DOX)的制備［16］。首先將DOX的羥基氧化為醛基，通過Schiff堿反應使其與BSA上氨基連接制備出BSADOX，然后于pH為9.5的緩沖溶液中與葉酸活性酯偶聯制備葉酸-BSA-DOX。

4　葉酸偶聯白蛋白納米粒的應用

葉酸偶聯白蛋白納米粒不僅具有白蛋白納米粒的應用優勢，還具有主動靶向性優勢，因此其作為一種新型理想的藥物載體，其應用前景廣闊。目前葉酸偶聯白蛋白納米粒最引人注目的應用還是將其作為抗腫瘤藥物的載體。

4.1作為抗腫瘤藥物的載體文獻報道的用葉酸偶聯白蛋白納米粒包封研究的抗腫瘤藥已有紫杉醇、多西紫杉醇、卡鉑、米托蒽醌、表沒食子兒茶素、5-氟尿嘧啶、硫酸長春堿、長春堿、10-羥基喜樹堿、多柔比星(阿霉素)、2-甲氧基雌二醇、順鉑等［17～23］。用葉酸偶聯白蛋白納米粒包封的上述抗腫瘤藥物的體外釋放試驗、體外細胞攝取實驗、細胞凋亡實驗及動物實驗研究表明:①這些葉酸偶聯白蛋白—抗腫瘤藥物具有穩定性高和藥物緩釋的特點。②由于葉酸受體葉酸僅在腫瘤細胞高表達，在正常組織無表達或很少表達，腫瘤組織特異性高。因此相較于白蛋白納米粒載藥體系，葉酸偶聯白蛋白載藥體系可通過腫瘤細胞表面的葉酸受體葉酸的介導而將其所攜載的抗腫瘤藥物主動靶向于葉酸受體葉酸表達陽性的腫瘤細胞(如人卵巢癌細胞SKOV3、前列腺癌細胞PC-3、宮頸癌細胞HeLa、胃癌細胞SGC7901細胞、肝癌細胞SMMC-7721、人鼻咽癌細胞KB等)，從而有效減少抗腫瘤藥物對正常組織和細胞的毒副作用。例如，Zhang等［23］構建的葉酸偶聯的2-甲氧基雌二醇(2-ME )白蛋白納米粒(2-ME-葉酸-BSANPs)靶向給藥系統，相比于對照組2-ME和2-ME-BSANPs來說，具有更強的靶向性，可有效快速的被肝癌細胞SMMC-7721攝入細胞內。體外實驗表明2-ME-葉酸-BSANPs對腫瘤細胞的抑制作用也顯著大于2-ME。

4.2作為化療、熱療、放療三合一的靶向載體對葉酸偶聯白蛋白納米粒載藥系統進行磁性修飾和放射性元素標記還可以使該載藥系統對癌細胞呈現出靶向性的放療、化療、熱療三重殺傷作用。Chen等［24］對葉酸偶聯人血清白蛋白包封Fe3O4磁性材料及順鉑的納米粒(葉酸-CDDP/HASMNPs)進行放射性核素標記制備出188Re-葉酸-CDDP/HASMNPs［25］。放射化學純度超過95%。該遞送系統將化療、磁感應溫度上升的理療及放射療法相結合。體外實驗表明在交變磁場下，其對癌細胞SKOV3具有靶向性的放療、化療、熱療三重殺傷作用。

4.3作為腫瘤診斷與檢測的載體水溶性熒光量子點CdTe具有高熒光強度和良好抗光漂白性能，適合腫瘤細胞的靶向識別與熒光標記及示蹤［26］。因此，包裹量子點或熒光素的葉酸偶聯白蛋白納米粒在葉酸受體表達陽性的腫瘤檢測及診斷方面具有潛在應用價值。Meng等［27］利用CdTe/ZnS量子點獲得葉酸偶聯牛血清白蛋白量子點納米粒(葉酸-BSA-QDs)。熒光顯微鏡下觀察到相較于葉酸受體表達陰性的人類胚胎腎細胞(293T)，葉酸受體表達陽性的人鼻咽癌細胞KB對葉酸-BSA-QDs的攝取顯著增強，并受到葉酸抑制。表明葉酸-BSA-QDs在葉酸受體表達陽性的癌癥的診斷方面具有潛在應用價值。

此外，Rollett等［28］研究顯示，葉酸受體表達陽性的巨噬細胞與葉酸-HSANPs的結合明顯增強，而活化的滑膜巨噬細胞在風濕性關節炎中發揮關鍵的作用，說明葉酸-HASNPs也可成為治療風濕性關節炎藥物的潛在載體。

5　結語

葉酸偶聯白蛋白納米粒是一個穩定的藥物遞送系統，可以改善藥物靶向于癌細胞，可作為靶向遞送抗癌藥物的載體。葉酸偶聯白蛋白納米粒具備白蛋白納米粒的安全無毒、生物相容性良好、無抗原性等多種優點，其作為一種新型理想的藥物載體還具有緩釋、生物利用度高、靶向、可減輕抗癌藥物的不良反應等優點。與白蛋白納米粒相比其獨特優點在于對于葉酸受體表達陽性的多種腫瘤細胞，葉酸偶聯白蛋白納米粒具有主動靶向性。因此，葉酸偶聯白蛋白納米粒在腫瘤治療及腫瘤在位檢測方面均具有非常重要的科學價值及應用價值。最近研究表明其還可以作為治療關節炎藥物的潛在載體。雖然葉酸偶聯白蛋白納米粒靶向藥物投遞系統的研究剛剛起步，尚處于細胞實驗和動物實驗階段，但由于其以白蛋白為載體，生物降解性高、無毒、有主動靶向性特點，其應用前景廣闊。

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(收稿日期:2015-03-17)

文章編號:1002-266X(2015) 22-0097-04

文獻標志碼:A

中圖分類號:R730.53

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.22.040