重癥肌無力患者血清乙酰膽堿受體抗體分類及自身抗體的檢測方法

李翠蘭，石其光

重癥肌無力（myasthenia gravis，MG）是主要累及神經肌肉接頭突觸后膜的乙酰膽堿受體（acetylcholine receptor，AChR） 由 B 細胞 /自身抗體介導、細胞免疫依賴、補體參與的自身免疫性疾病［1，2］。 近年來，AChR 抗體的檢測方法得到了很大發展，靈敏度和特異性也有了提升。但仍有一部分MG患者血清AChR抗體陰性，研究發現部分AChR抗體陰性的MG患者血清中含有特異性針對肌肉特異性受體酪氨酸激酶 （muscle specific receptor tyrosine kinase，MuSK）及低密度脂蛋白受體相關蛋白 4（low－density lipoprotein receptor－related protein 4，LPP4）的抗體。

1 血清AChR抗體陽性MG

目前認為，AChR是大多數MG患者的特異性自身抗原，分為兩種亞型，胚胎型AChR由α2、β、δ、γ亞基組成，主要存在于胎兒的肌肉中，出生后γ亞基逐漸被ε亞基取代，稱為成熟型AChR，其由α2、β、δ、ε亞基組成［3］。 目前認為在成人骨骼肌中只有眼外肌同時表達成熟型和胚胎型AChR亞單位，其他骨骼肌只表達成熟型亞單位［4］。乙酰膽堿受體有兩個乙酰膽堿結合位點，分別位于α與γ或ε，α與δ之間［3］。主要免疫原區域位于α亞基的67～76位氨基酸殘基［5］。因此重癥肌無力患者血清中主要含有針對AChR－α亞基的抗體［6］。但后來研究發現，另有少部分患者含有特異性針對AChR－γ和AChR－ε 的抗體［7］。 AChR 抗體類型為 IgG，主要亞型為IgG1和IgG3［8］。抗體發揮作用可能有3種機制［9］，即：①補體固定并激活引起突觸后膜溶解導致含AChR的膜損傷、釋放AChR－抗體—補體復合物至突觸間隙；②可能通過蛋白質的環鏈和內在化調節AChR數量；③抗AChR抗體直接與AChR結合引起功能阻滯。

2 血清AChR抗體陰性MG

2.1 MuSK抗體陽性MG MuSK是表達于骨骼肌神經肌肉接頭的酪氨酸激酶受體，胞外區有4個Ig樣區域和1個半胱氨酸聚集區組成，胞內區有1個激酶區、近膜區和羧基末端尾部組成［10］。其功能是運動神經釋放的聚集蛋白（Agrin）同肌肉細胞表面的MuSK受體接觸，活化MuSK，引起細胞支架蛋白（Rapysn）聚集，然后Rapysn啟動AChR和和表皮生長因子受體（erbBR），促使骨骼肌表面突觸后膜上AChR 聚集［11，12］。 肌肉活檢發現 MuSK－Ab 陽性的MG患者，神經肌肉接頭處的AChR數量較正常組無明顯差異。這一點同AChR抗體陽性的MG患者不同，后者AChR數量明顯減少。MuSK－Ab主要通過與MuSK的胞外區結合后，抑制AChR聚集相關蛋白的功能，進而抑制AChR在突觸后膜的聚集，影響神經肌肉接頭信息傳遞［13］。同AChR－Ab主要由 IgG1型 IgG3型組成不同，MuSK－Ab主要為IgG4型，其發揮作用并不通過激活補體。所以通常在MuSK－Ab陽性的MG患者神經肌肉終板上并無補體 C3 的沉積［7］。

2.2 低密度脂蛋白受體相關蛋白4（LPP4）抗體陽性MG 盡管目前血清AChR抗體檢測方法的敏感性和特異性較以往有了較大的提高，但是仍有近5%～10%的MG患者血清AChR抗體和MuSK抗體陰性。近年來，低密度脂蛋白受體相關蛋白4已被證實為骨骼肌細胞膜上聚集蛋白（agrin）的受體［14，15］。LPP4表達在神經肌肉突觸后膜上，其通過與聚集蛋白的結合從而活化MuSK，在MuSK胞外區域形成細胞支架，招募其他成分組成一個突觸后膜的復合體，促使突觸后膜上AChR的聚集［16］。2011年，Higuchi等［16］首次在 300例 AChR抗體和 MuSK抗體均陰性的患者血清中發現了9例抗LPP4的抗體，隨后于2012年，Higuchi和Waters分別在研究中發現，約50%和9.2%的雙抗體陰性的MG患者血清中含有 LPP4 的抗體［16，18］。目前認為，LPP4 的抗體導致肌無力的可能通過以下兩種機制干擾突觸后膜AChR的聚集：①LPP4的抗體影響聚集蛋白和LPP4結合；②LPP4的抗體影響LPP4和MuSK的相互作用［16］。 研究發現，LPP4的抗體主要為IgG1，通過激活補體而發揮其致病作用［17］。以上研究均表明LPP4作為一種新的自身抗原，在AChR抗體和MuSK抗體均陰性的患者血清中可能含有針對LPP4的抗體。

3 MG中自身抗體的檢測方法

3.1 放射免疫沉淀法 （RIPA） 早在1960年人們就認識到重癥肌無力是由于患者體內存在抗肌肉終板蛋白自身抗體，到20世紀70年代發現該抗體所針對的靶抗原為AChR。這個發現是歸功于環蛇毒素（a－BuTX），它能特異性地結合肌肉AChR。此方法所需的標記有125I－α－銀環蛇毒素的AChR抗原最初是來源于去神經支配的骨骼肌，其主要為胚胎型AChR。隨著抗原提取方法的不斷改進，后來有人將表達AChR－ε的基因轉染進TE671細胞，這樣TE671細胞可同時表達成熟型和胚胎型兩種不同類型的AChR，這進一步提高了AChR抗體檢測的敏感性。盡管后來放射免疫法亦廣泛用于MuSK抗體的檢測，但是其本身具有放射性及其技術缺陷，以后，為避免使用核素，各種非放射性檢測方法應運而生。

3.2 非放射性方法 ①酶聯免疫吸附測定（ELISA）：此方法主要原理為以α－銀環蛇毒素包被酶標板，并與骨骼肌勻漿（含AChR）作用，再加入待測血清和對照血清，最后加HRP標記的二抗，于酶標儀上測492 nm吸光度。以陽性混合血清作為標準血清，制備標準曲線。待測血清中抗AChR抗體含量，可根據吸光度從標準曲線上換算。因為其檢測效率較RIPA并未提高，因此此方法并未被常規使用。盡管上述乙酰膽堿受體抗體檢測方法不斷改進，但是仍有一部分MG患者血清抗體陰性，此外，隨著熒光免疫技術的不斷成熟，因此一種新的、利用熒光免疫技術檢測AChR抗體的方法開始出現。②熒光免疫沉淀法（FIPA）：利用標記有熒光蛋白的抗原，此方法最早被用于視神經脊髓炎 （neuromyelitis optica，NMO）中 AQP－4 抗體的檢測［19］。 此方法的優點是，可以通過標有不同顏色的熒光蛋白同時進行針對不同抗原的多種抗體的檢測。例如，可以對重癥肌無力患者同時進行AChR抗體和MuSK抗體的檢測。此方法將增強綠色熒光蛋白（EGFP）標記的AChR 4種不同的亞基按照自然比并在聚乙烯亞胺 （PEI）介導下轉入人胚腎細胞（HEK－293），后通過裂解細胞來獲取標記有EGFP的AChR，使其與待測血清混合，后加入二抗，通過酶標儀讀取熒光值來判斷結果［2，19］。此方法同RIPA方法具有較高的相關性。③熒光細胞染色方法（CBA）：考慮到傳統的RIPA方法，其抗原處于溶液中，且較分散，而神經肌肉接頭處的AChR通過聚集蛋白（rapsyn）的連接而以高度密集的狀態存在。通常情況下AChR抗體同高度密集表達在細胞表面的AChR結合性最好。因此有人推測血清陰性MG（SNMG）患者中可能含有低親和力的AChR抗體，這些低親和力的抗體同溶液中相對分散的AChR不易結合，從而造成那些含有低親和力抗體的MG患者血清抗體檢測結果陰性。2008年，有研究報道首次應用熒光免疫細胞染色技術在66%的“血清陰性”的重癥肌無力患者血清中檢測出呈低親和力的AChR抗體［7］。該項檢測技術的工作原理及獨特之處在于：通過聚集蛋白rapsyn使AChR蛋白的5個亞基聚集并濃縮表達在細胞表面，不僅使抗原抗體的結合反應從傳統的放射免疫沉淀法液相環境改進為生長活躍的活性細胞表面，為下一步的熒光顯微鏡下肉眼觀察與抗原結合的抗體提供了直觀、形象的讀片平臺；而且提高了細胞表面反應環境中的抗原濃度，進而增加其與血清中AChR抗體結合能力［2，7］。綜上所述，此方法較其他方法更敏感。

目前仍有部分患者臨床表現和輔助檢查類似MG的患者血清中上述抗體均為陰性。因此對于MG患者血清抗體的檢測仍有待于進一步提高，對于MG患者血清中是否還含有針對其他自身抗原的MG相關抗體，目前尚不明確。

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