超順磁性氧化鐵納米顆粒的理化性質(zhì)及其標(biāo)記BMSCs的安全性、示蹤時效性研究進(jìn)展

王海龍，張良，郭艾

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院，北京100050)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是良好的組織工程載體細(xì)胞［1，2］，在組織損傷的修復(fù)與重建方面起重要作用［3］。隨著干細(xì)胞移植技術(shù)的深入發(fā)展，動態(tài)監(jiān)測移植后移植細(xì)胞的分化和生存狀態(tài)，了解干細(xì)胞移植的治療機制，評估移植效果等問題成為下一步研究工作的重點。自1999年提出了分子影像學(xué)(MI)概念［4］后，應(yīng)用磁共振(MR)對比劑標(biāo)記細(xì)胞已有10余年的歷史，上個世紀(jì)90年代末就已經(jīng)提出“納米醫(yī)學(xué)”概念。近年來，超順磁性氧化鐵納米顆粒(SPIONs)標(biāo)記干細(xì)胞的技術(shù)已被用于細(xì)胞MR活體示蹤和細(xì)胞磁靶向研究，成為探索細(xì)胞移植機制和改善療效的有力工具。本文就SPIONs的理化性質(zhì)及其標(biāo)記BMSCs的安全性、示蹤時效性研究進(jìn)展作一綜述。

1 SPIONs相關(guān)理化性質(zhì)

SPIONs的基本結(jié)構(gòu)多是以葡聚糖包裹氧化鐵顆粒而得，直徑在納米數(shù)量級，粒度的大小將影響其在體內(nèi)分布的特異性和磁化特性。根據(jù)粒度的大小，超順磁性氧化鐵(SPIO)可分為普通型SPIO(直徑40～400 nm)和超微型SPIO(USPIO，最大直徑＜30 nm)兩類。Feridex@是SPIO類造影劑的典型代表，而Combidex@是USPIO類造影劑的典型代表。

1.1 磁性納米晶體的合成 目前，臨床用商品化的磁性納米顆粒均采用共沉淀法制備。共沉淀法的原理是通過化學(xué)計量比的二價和三價鐵離子在特定pH值及穩(wěn)定劑存在的情況下，通過水解、陳化反應(yīng)來實現(xiàn)磁性氧化鐵納米顆粒的制備;之后，應(yīng)用高溫?zé)岱纸庵苽浼夹g(shù)，使磁性氧化鐵納米顆粒結(jié)晶度更高、磁響應(yīng)性更強，納米晶體的單分散性更好，表面修飾結(jié)構(gòu)更清晰［5，6］。

1.2 SPIONs的表面化學(xué)修飾 由于SPIO與細(xì)胞膜均帶負(fù)電，未經(jīng)修飾無法有效標(biāo)記BMSCs;同時，為了提高其穩(wěn)定性、預(yù)防顆粒間的聚集、保證生理條件下的無毒狀態(tài)及增強其靶向功能，在這些顆粒表面涂以合適的分子材料進(jìn)行表面修飾是必要的。目前，多采用帶正電荷的轉(zhuǎn)染劑如多聚賴氨酸、硫酸魚精蛋白、繁枝體等通過靜電包裹鐵顆粒，使帶負(fù)電的細(xì)胞通過非特異性膜表面吸收過程攝取鐵顆粒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。陳鵬等［7］采用無葡聚糖包被超順磁性氧化鐵納米顆粒標(biāo)記大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，50 mg/L質(zhì)量濃度的無葡聚糖包被SPIONs可100%標(biāo)記細(xì)胞，且細(xì)胞毒性及對細(xì)胞增殖活性的影響較小。李冰玉等［8］采用SPIONs鐵羧葡胺(SHU 555A，商品名為Resovist)標(biāo)記大鼠BMSCs，50 mg/L質(zhì)量濃度的Resovist普魯士藍(lán)染色顯示，細(xì)胞內(nèi)均可見大量著色顆粒，標(biāo)記率接近100%;電鏡檢查顯示，胞質(zhì)內(nèi)有含鐵致密顆粒囊泡，未見氧化鐵對細(xì)胞微細(xì)結(jié)構(gòu)的破壞和毒性作用;原子吸收分光光度法測定結(jié)果顯示，細(xì)胞平均鐵含量30 pg。Resovist標(biāo)記和外加磁場對細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞活力均無明顯影響。胡豐等［9］用葉酸偶聯(lián)的超順磁Fe3O4納米顆粒，不僅細(xì)胞毒性小，而且通過其表面的葉酸與葉酸受體的高強結(jié)合作用被高效介導(dǎo)進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，增強MR成像(MRI)中腫瘤組織與周圍正常組織的對比度，有利于腫瘤細(xì)胞的標(biāo)記、示蹤和靶向檢測，是一種很有應(yīng)用前景的腫瘤細(xì)胞靶向檢測物質(zhì)。

2 SPIONs標(biāo)記BMSCs的安全性

大量實驗研究表明，SPIONs是存在毒性的，認(rèn)為靶位點的鐵過量是產(chǎn)生相關(guān)毒性的原因之一。包衣離解后，靶位點高濃度的裸露氧化鐵納米顆粒會造成內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡。這將引起一系列細(xì)胞應(yīng)答，進(jìn)而導(dǎo)致DNA損害、炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激、基因突變、細(xì)胞骨架破壞等細(xì)胞毒性。SPIONs在細(xì)胞內(nèi)化過程中可被溶菌酶溶解，從而釋放出游離鐵。這些游離的二價鐵離子可與線粒體內(nèi)的過氧化氫或氧氣相互作用產(chǎn)生游離的反應(yīng)性自由基，進(jìn)而產(chǎn)生基因毒性［10］。另外，SPIONs也會因劑量的增大影響免疫功能［11］。Mahmoudi等［12］研究表明，SPIONs 因使被標(biāo)記的細(xì)胞離子平衡和蛋白功能局部形成了氣體囊泡，是其產(chǎn)生毒性的主要原因。同時，越來越多的證據(jù)表明，顆粒的理化特性在其毒性方面起了重要作用，主要影響因素包括顆粒的大小、形狀、純度以及表面所帶電荷等。顆粒越小越易進(jìn)入細(xì)胞，與細(xì)胞內(nèi)成分相互作用從而影響細(xì)胞的功能;有研究表明，球形顆粒更易被細(xì)胞攝取;納米材料制作過程中的金屬殘留污能引起細(xì)胞毒性反應(yīng)［13］。但大量實驗研究也表明，在適當(dāng)濃度下，SPIONs標(biāo)記BMSCs對細(xì)胞的生物學(xué)特性無明顯影響［14］。多篇文獻(xiàn)報道，當(dāng)SPIONs標(biāo)記移植細(xì)胞的培養(yǎng)液濃度為25～50 mg Fe/L時，可有效標(biāo)記細(xì)胞(標(biāo)記率可達(dá)99%)，且對細(xì)胞的活力、生長、分化、功能以及其他生物活性均無不利影響，也無毒性［15］。張瑞平等［16］總結(jié)前人的研究結(jié)果得出20～50 mg Fe/L為安全而又有效的標(biāo)記濃度，低于20 mg Fe/L培養(yǎng)液則無法有效標(biāo)記或需增加標(biāo)記后的孵育時間，而高于50 mg Fe/L培養(yǎng)液將使細(xì)胞的生物學(xué)活性受到不同程度的抑制。Struys等［17］研究認(rèn)為，SPIONs有效標(biāo)記干細(xì)胞的最低質(zhì)量濃度為15 mg Fe/L。

3 SPIONs標(biāo)記BMSCs的MR示蹤時效性

Ittrich等［18］實驗證實，細(xì)胞對鐵顆粒的吸收與氧化鐵和細(xì)胞的濃度均呈正相關(guān)。細(xì)胞內(nèi)鐵顆粒越多，MRI會更明顯;但細(xì)胞內(nèi)過多的鐵又會對細(xì)胞產(chǎn)生毒性，影響其增殖、分化能力，從而影響活體成像的追蹤觀察。顏榮華等［19］用Fe3O4@CdTe@SiO2納米顆粒標(biāo)記大鼠BMSCs實驗證實，標(biāo)記組3×106至5×104個細(xì)胞的T2WI、T2*WI信號明顯減低，以3×106最顯著;隨著細(xì)胞數(shù)量級的減小，信號逐漸縮小，數(shù)量級 ＜1×104幾乎不能被檢測到。Kraitchman等［20］利用SPIONs標(biāo)記BMSCs經(jīng)導(dǎo)管注入犬心肌梗死模型周邊區(qū)域，術(shù)后持續(xù)8周，1.5 T MRI仍可明確觀察到移植部位發(fā)出1條低信號。Jin等［21］將SPIONs標(biāo)記的兔BMSCs注射到兔膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨缺損模型中，在隨后的12周內(nèi)MRI檢測都觀察到兔膝關(guān)節(jié)內(nèi)的信號減低區(qū)，病理切片證實損傷軟骨內(nèi)可觀察到標(biāo)記的干細(xì)胞。顧玉梅等［22］將SPIONs作為示蹤劑在MR下對移植入大鼠梗死邊緣區(qū)的BMSCs進(jìn)行體內(nèi)追蹤，SPIONs標(biāo)記MSCs陽性率達(dá)95%，對MSCs的活性和分化無明顯影響。磁性細(xì)胞移植組術(shù)后3、7、14 d在MR T2像顯示的低信號注射點依次減少，術(shù)后21 d不能顯示注射點;并隨時間的延長，低信號區(qū)域邊界模糊，范圍擴(kuò)大，信號對比度降低。孟增東等［23］觀察移植入股骨頭壞死區(qū)的 SPIONs標(biāo)記的 BMSCs在 SE T2WI、FSE T2WI、GRE T2WI 3 種掃描序列中信號變化情況，移植后4周行MRI掃描，標(biāo)記組的低信號區(qū)均明顯減弱，移植后6周已難分別出低信號區(qū);同時，移植后6周觀察到標(biāo)記細(xì)胞移植側(cè)低信號區(qū)面積漸增大，表明SPIONs標(biāo)記的BMSCs移植后在股骨頭壞死區(qū)的遷徙、擴(kuò)散。

隨著干細(xì)胞移植醫(yī)學(xué)的發(fā)展，對干細(xì)胞活體示蹤技術(shù)方法的研究愈加迫切。SPIONs的物理特性、標(biāo)記干細(xì)胞的機制，以及標(biāo)記后對干細(xì)胞的影響已有大量實驗研究，但目前還主要進(jìn)展到體外研究和動物實驗階段。干細(xì)胞在體內(nèi)如何參與修復(fù)過程、如何向成骨或成血管方向分化，是有待解決的重要問題;如何提高活體示蹤物在體內(nèi)的觀察對比度，以及如何延長示蹤物在體內(nèi)的觀察時間等問題仍待進(jìn)一步研究。

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