高壓氧治療對急性重癥胰腺炎大鼠脾細胞凋亡的影響

任一鵬，趙鵬，武祎，張國志，蘇春，王長友

(1河北聯合大學附屬醫院，河北唐山063000;2內蒙古醫科大學;3遵化市人民醫院)

急性重癥胰腺炎(SAP)常出現全身炎癥反應綜合征(SIRS)，并發多器官功能不全(MOF)，致死率高［1］。目前研究認為，免疫功能失調在其中發揮了重要作用［2，3］。脾臟是人體最大的外周免疫器官，勢必參與其中。高壓氧治療具有調控免疫功能、清除炎癥介質和細胞因子以及調節細胞凋亡與信號轉導等作用。我們前期研究發現，SAP大鼠造模后6 h脾臟細胞凋亡最為明顯。2013年11月～2014年10月，我們觀察了高壓氧對SAP大鼠脾細胞凋亡的影響，并探討其可能的機制，為臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級SD雄性大鼠75只，體質量200～250 g，由河北聯合大學動物實驗中心提供。牛磺膽酸鈉(Sigma公司)，TUNEL試劑盒(羅氏公司)，Bax、Bcl-2一抗(碧云天公司)，HPR標記山羊抗兔二抗及山羊抗小鼠二抗(碧云天公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組與造模 將30只大鼠隨機分為觀察組和對照組各15只，均經膽胰管注射牛黃膽酸鈉構建SAP大鼠模型［4］。觀察組于造模完成后60 min內，置于密閉的高壓氧艙內2 h(包括升壓0.5 h、穩壓1 h、減壓 0.5 h)，艙內壓力為 2.0 ATA，氧濃度為 98%［5］。

1.2.2 腹水測量及血清淀粉酶(AMY)檢測 造模后6 h開腹，用注射器吸盡大鼠腹腔腹水，置于量筒中測量。然后，處死大鼠后經門靜脈取血，25℃于離心機上以3 000 r/min離心10 min，取上層血清于-80℃冰箱保存，用全自動生化儀檢測血清AMY。

1.2.3 胰腺組織觀察 留取胰腺組織，行HE染色，電鏡下觀察胰腺組織變化。

1.2.4 脾細胞凋亡指數(AI)測算 留取部分脾，按照試劑盒說明書進行操作;凋亡細胞胞核為棕褐色，核圓縮，碎裂呈散塊狀。AI計算方法為高倍鏡(40×10)下選定5個視野，每個視野計數100個細胞，計算其中凋亡細胞數所占比例。

1.2.5 脾臟Bax和Bcl-2檢測 采用 Western blot法。取部分脾，經液氮研磨后加入冷PBS，勻漿;反復離心至上清，棄去上清液;加入PMSF與裂解液的混合液(1∶100)，冰上裂解30 min;4℃下15 000 r/min離心15 min，取上清液，置于-80℃保存。按測定試劑盒說明測定樣品蛋白濃度，計算上樣量。行SDS-PAGE電泳，經硝酸纖維素膜轉移;10%脫脂奶粉封閉，加一抗，4℃搖床過夜。回收一抗，PBS洗膜3次，10 min/次;加入相應二抗孵 1.5 h，回收二抗;PBS洗膜3次，10 min/次。按照 BeyoECL Plus說明顯色，X線膠片曝光。以β-Tublin孵育，作為內參照;以目的蛋白與內參條帶光密度比值，作為Bax和Bcl-2表達量。

1.2.6 統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件。所得數據以±s表示，組間比較用t檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組腹水及血清 AMY比較 觀察組腹水(5.80 ±0.76)mL、血清 AMY(1 140.0 ±31.03)U/L，對照組分別為(11.40 ±1.140)mL、(2 673.20 ±104.35)U/L，P 均 ＜0.05。

2.2 兩組胰腺組織病理觀察結果 對照組葉間隙及腺泡間隔顯著擴張，間質血管擴張充血，大量炎癥細胞浸潤，面積不等的腺細胞壞死;觀察組胰腺組織間質水腫、炎癥細胞浸潤減輕、少量片狀出血、壞死。

2.3 兩組脾臟 AI比較 觀察組 AI為30.07% ±1.14%，對照組為58.07% ±2.37%，P ＜0.05。

2.4 兩組脾臟Bax和Bcl-2表達比較 觀察組脾臟 Bax表達量 0.991 4 ±0.115 4、Bcl-2 表達量0.771 5 ±0.033 2，對照組分別為 0.679 5 ±0.046 4、0.817 9 ±0.022 9，P 均 ＜0.05。

3 討論

細胞凋亡在分子水平有著復雜的調控過程，其中Bcl-2家族是重要的調控基因之一，可以分為促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白。我們選取了最具代表性的促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2。Bcl-2高表達時，可與Bax形成異源二聚體，拮抗細胞凋亡，使其得到保護;如果在應激等狀態下，Bax表達上調，Bax之間形成同源二聚體，促進細胞凋亡［6～8］。

目前，高壓氧已廣泛應用于治療一氧化碳中毒、動脈氣體栓塞及一些厭氧菌感染和腦血管等缺血缺氧性疾病［9］。現有研究證明［10，11］，高壓氧可減少SIRS狀態下TNF-α的分泌，并通過缺血缺氧組織的供氧，阻斷細胞能量代謝障礙，防止細胞凋亡;同時，也可以通過減少氧自由基的產生，抑制生物膜的脂質過氧化，從而阻斷細胞的凋亡過程。

實驗證明，脾細胞凋亡在SAP發生后顯著增加，其機制尚不完全明確，可能與SAP早期過度炎癥反應及炎癥介質、細胞因子和氧自由基等大量釋放有關［12，13］。但是，脾臟作為最大的外周免疫器官，脾細胞大量凋亡使得免疫細胞耗竭嚴重，從而使機體對抗原刺激不能產生有效應答，進而無法產生有效保護性免疫反應［14］。本研究顯示，與對照組比較，造模后6 h觀察組腹水量減少，血清AMY降低，胰腺炎性損傷減輕，脾臟細胞AI降低，脾組織中的Bax表達降低、Bcl-2表達增加。因此我們認為，該作用可能通過調節Bcl-2、Bax表達來抑制脾細胞的凋亡，調控機體免疫功能狀態，保持機體免疫平衡，從而明顯緩解SAP過程中的免疫抑制。但是，高壓氧治療的臨床效果還有待進一步研究，且它僅是一種輔助性的治療手段，尚不能完全替代常規SAP治療方法。同時，有文獻指出，長期吸入高濃度的氧也會加劇毛細血管內皮損傷，引起血管外滲出［15］。因此，如何制定合理的治療方案，包括如何選擇高壓氧治療的治療壓力、治療時間、氧氣濃度等仍是下一步研究的方向。

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