dlx基因在中國首例ADULT綜合征患者發病中的作用

王霞，楊健，楊文林，熊春萍(廣州醫科大學附屬第一醫院，廣州500;廣州醫科大學附屬第二醫院)

dlx基因在中國首例ADULT綜合征患者發病中的作用

王霞1，楊健2，楊文林2，熊春萍1
(1廣州醫科大學附屬第一醫院，廣州510120;2廣州醫科大學附屬第二醫院)

摘要:目的探討dlx基因與ADULT綜合征發生的關系。方法對中國首例ADULT綜合征患者及其4代家系共17例成員的dlx基因家族進行PCR擴增并測序，觀察ADULT綜合征家系中dlx基因家族成員的遺傳學改變。結果在患者及其父系家族5例成員(包括患者父親)的dlx3基因第2內含子發現1個相同的單核苷酸多態性(cSNP)位點cSNP(A/G) rs760088，而母系家族成員未發現cSNP(A/G) rs760088，父系cSNP(A/G) rs760088發生率高于母系(P=0.034)。結論ADULT綜合征的發病可能與dlx3基因有關，而且患者與其父系家族成員可能存在更多的遺傳相關性。

關鍵詞:遺傳性疾病，先天性; ADULT綜合征; dlx基因;單核苷酸多態性

ADULT綜合征是一種典型的外胚層發育異常綜合征，屬于常染色體顯性遺傳［1，2］。2010年我們發現了國內首例ADULT綜合征家系，并觀察到ADULT綜合征患者p63基因的第8外顯子發生了錯義突變(R298Q)［3～6］。ADULT綜合征的臨床表現有四肢發育畸形、神經性皮炎改變(包括指趾剝脫性皮炎)、皮膚干燥、乳腺和乳頭發育不全或缺失、缺指(趾)畸形和并指癥、指(趾)甲發育異常、淚管閉鎖、少汗、牙齒發育不全等癥狀。由于p63基因在胚胎發育(特別是在四肢和其他外胚層衍生器官的發育)中起著重要作用。近年來研究發現，dlx基因家族和p63基因在調控外胚層發育中可能歸屬于相同的信號傳導通路。dlx基因家族包括6個成員，并分為3組(dlx1/dlx2、dlx3/dlx4、dlx5/dlx6)，該基因家族在哺乳動物的外胚層(包括表皮、肢體、生殖器、腮腺、牙齒和毛發等)發育、神經發育、紅細胞的生成及胎盤的發育中都起著重要的作用。新的研究證實p63基因的異構體TAp63調控dlx基因家族中的dlx3基因的表達。ΔNp63轉錄調控dlx5/dlx6基因，而p63基因的錯義突變與dlx5/dlx6部分功能的缺失可導致嚴重的肢體發育畸形［9］。以上研究提示p63可能通過調控dlx基因的表達在外胚層發育不良中發揮重要作用［7～9］。2011年11月～2013年6月，我們在前期研究的基礎上，進一步探討我國首例ADULT綜合征家系中dlx基因的遺傳學改變及dlx基因與ADULT綜合征發生的關系。

1　資料與方法

1.1臨床資料以中國首例ADULT綜合征患者及其4代家系(見圖1)成員共17例為觀察組，男10例、女7例，年齡18～72歲，中位年齡36歲。ADULT綜合征患者為女性，29歲。主要臨床表現:毛發稀少，唇系帶和舌下系帶發育不良，右手并指，顏面部大量雀斑，少汗，汗毛稀少，溢淚，左眼淚道閉鎖、右眼淚道狹窄，牙齒發育不全;符合ADULT綜合征的臨床診斷標準［10］。患者及其姑姑、姐姐乳腺和乳頭發育不良，患者及其父系家族成員軀干部位長有散在小片萎縮斑，男性較明顯。患者母系家族成員未發現與ADULT綜合征相關的體征。另取正常人30例為對照組，男14例、女36例，年齡16～75歲，中位年齡41.5歲;個體之間無血緣關系。各研究對象及其家屬對本研究均知情同意。

1.2dlx基因檢測檢測材料包括人外周血DNA提取試劑盒(MACHEREY-NAGEL，Germany)、PCR擴增試劑(Promega，USA)、引物序列設計(PrimerPrimer5.0)、引物合成(上海生工生物工程技術有限公司)、瓊脂糖(GENE，USA)、6×Loading Buffer(寶生物工程有限公司)、溴化乙錠(儲存液10 mg/mL、工作液0.5 mg/mL，廣州威佳生物技術公司)、DNA Marker(2 000 bp，寶生物工程有限公司)、SYBR Green熒光染料等(GENE，USA)、PCR產物回收純化試劑盒及質粒抽提試劑盒(QIAGEN，Germany)。具體檢測方法如下:①人外周血DNA的提取:采用人外周血DNA提取試劑盒，嚴格按照說明書操作。提取的DNA分裝5個1.5 mL EP管，－20℃保存。②引物設計:根據Zhou等［11］方法原理，應用Primer Premier 5.0軟件設計引物并委托上海英駿生物技術有限公司合成。dlx3基因引物序列:第1外顯子的上游引物為: 3'-ACGGTGAACCCCTACACCTA-5'，下游引物為: 3'-TCTTGGGCTTCCCATTCACC-5';第2外顯子的上游引物為: 3'-TCCTTCGATCGCAAGCTCAG-5'，下游引物為: 3'-TGGTGGTAGGTGTAGGGGTT-5';第3外顯子的上游引物為: 3'-TACCTACGGAGCCTCCTACC-5'，下游引物為: 3'-ACTCAGGTTCTGTGCGTGAT-5'。③PCR擴增:取人外周血DNA 95℃變性5 min，95℃30 s，根據1～3外顯子選擇不同退火溫度，30 s，72℃1 min，35個循環;延伸72℃5 min，擴增產物4℃保存。④PCR產物電泳、判定:取瓊脂糖0.6 g加入40 mL 0.5×TBE液中，微波爐加熱2 min，冷卻至50℃左右，加入1.5% EB液1.5 mL，膠倒置膠槽中。分別取PCR產物5 μL、6×Loading Buffer 0.5 μL，混勻，加樣于1.5%瓊脂糖凝膠的加樣孔中。室溫下恒壓(120 V)電泳30 min。然后置于紫外反射投影儀上檢測PCR擴增產物。在紫外線燈下切取PCR目的條帶裝入1.5 mL EP管;每10 mg膠加入10 μL Membrance Binding Solution混勻，水浴50～65℃，使膠完全融化，其間不停混勻;收集管插入SV柱，把樣品加到SV柱上，室溫1 min;16 000 g離心1 min，倒掉收集管剩余液體;加入700 μL Membrance Wash Solution，16 000 g離心1 min，倒掉收集管中液體;加入500 μL Membrance Wash Solution，16 000 g離心5 min;倒掉收集管中液體，離心1 min;把SV柱放入1.5 mL EP管內; 在SV柱中央加入50 μL Nuclease-Free Water，室溫1 min，16 000 g離心1 min;回收產物，－20℃保存。確認目的片段后，將切膠回收，PCR產物送往英駿生物技術有限公司進行測序，分析突變位點。

1.3統計學方法采用SPSS19.0統計軟件。父系與母系之間單核苷酸多態性(cSNP)位點發生率比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

觀察組中患者及其父系家族5例成員(Ⅱ: 1，3，4，Ⅲ: 8，11)的dlx3基因第2內含子發現1個相同的cSNP位點cSNP(A/G) rs760088，而母系成員未發現該cSNP(A/G) rs760088;父系家族與母系家族cSNP(A/G) rs760088發生率比較有統計學差異(P=0.034)。對照組中未發現該cSNP (A/G) rs760088。兩組rs760088測序見圖2。

3　討論

ADULT綜合征由Propping等［2］在1993年首次報告并命名，其主要臨床表現有四肢發育畸形、神經性皮炎改變(包括指趾剝脫性皮炎)、皮膚干燥、乳腺和乳頭發育不全或缺失、缺指(趾)畸形和并指癥、指(趾)甲發育異常、淚管閉鎖、少汗、牙齒發育不全等癥狀［5］。p63基因在胚胎發育(特別是在四肢和其他外胚層衍生器官的發育)中起重要作用［6］。dlx基因家族包括6個成員，并分為3組(dlx1/dlx2、dlx3/dlx4、dlx5/dlx6)，該基因家族在哺乳動物的外胚層(包括表皮、肢體、生殖器、腮腺、牙齒和毛發等)發育、神經發育、紅細胞生成及胎盤發育中都起著重要作用［7］。研究證實p63基因的異構體TAp63調控dlx基因家族中dlx3基因表達［8］。ΔNp63轉錄調控dlx5/dlx6基因，而p63基因的錯義突變與dlx5/dlx6部分功能的缺失可導致嚴重的肢體發育畸形［9］。dlx基因家族是一類重要的調控外胚間充質細胞分化的轉錄因子，具有決定細胞命運，維持組織發育的功能［12］。dlx基因在各種發育位置均有表達，特別是在上皮間充質細胞相互作用的區域(鰓弓、胚芽、前腦、聽囊、嗅囊、牙、毛囊)。Fujimoto等［13］發現dlx3基因、p63基因與外胚層發育不良有直接的相關性。尤其是毛囊、牙齒、表皮等的發育與dlx3基因關系更為密切。

在基因組DNA中，任何堿基均有可能發生變異，因此SNP既有可能在基因序列內，也有可能在基因以外的非編碼序列上。總的來說，位于編碼區內的cSNP比較少，其變異率僅為周圍序列的1/5，在遺傳性疾病研究中卻具有重要意義，因此cSNP的研究更受關注［14］。大多數疾病屬于由遺傳因素與環境因素共同作用所致的復雜疾病。SNP在醫學遺傳學方面，不僅可用于尋找致病基因，還可用于診斷疾病，尤其是單基因遺傳病［15］。尋找和研究SNP已成為人類基因組計劃的主要內容和目標。發現這些與常見疾病相關的DNA序列上的多態位點，是了解引起人類疾病復雜原因最重要的途徑之一。

本研究DNA產物測序分析結果顯示患者及其父系家族5名成員的dlx3基因第2內含子發現1個cSNP(A/G) rs760088，而母系成員未發現該位點。因此認為該例ADULT綜合征患者的發病與父系家族有更多的遺傳學相關性。

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(收稿日期2014-12-25)

基金項目:廣州醫科大學科研基金課題(2011A10)。

文章編號:1002-266X(2015)21-0032-03

文獻標志碼:B

中圖分類號:R596

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.21.012