梗死區骨髓間充質干細胞注射對心肌梗死豬心臟結構形態及心功能的影響

解飛(西安醫學院第二附屬醫院，西安710038)

梗死區骨髓間充質干細胞注射對心肌梗死豬心臟結構形態及心功能的影響

解飛
(西安醫學院第二附屬醫院，西安710038)

摘要:目的觀察心肌梗死豬梗死區骨髓間充質干細胞注射后心臟結構形態及心功能的變化，探討同種異體骨髓間充質干細胞移植對心肌梗死豬的治療作用。方法取21只健康成年家豬，其中1只用于分離其骨髓間充質干細胞，另外20只構建心肌梗死模型;于造模1 h后隨機各選擇10只分別于梗死區選擇3點注射骨髓間充質干細胞(實驗組)或生理鹽水(對照組) 0.2 mL。飼養1個月，記錄兩組的存活情況，二維超聲心動圖觀察兩組動物的心臟結構形態及心功能。結果經鑒定實驗獲取的豬四肢骨單個核細胞為骨髓間充質干細胞。成功構建豬心肌梗死模型。細胞移植后1個月，實驗組存活10只、對照組存活9只;二維超聲心動圖檢查結果顯示兩組心臟結構無明顯差異;實驗組左室射血分數［(41.64±5.26) %］明顯高于對照組［(36.73±4.32) %］(P＜0.05)。結論骨髓間充質干細胞移植可改善心肌梗死豬的心功能，但是對心臟結構影響較小。

關鍵詞:心肌梗死;骨髓間充質干細胞;細胞移植;心臟功能;豬

由于心肌細胞是不可再生細胞，目前尚無使壞死心肌細胞再生的方法，也無法從根本上改善心功能［1］。干細胞是一類具有自我復制和多向分化潛能的細胞，可向骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌細胞、神經細胞等分化，且植入宿主后可長期存活［2～5］。干細胞同樣具有分化為心肌細胞的能力，這為干細胞移植治療心肌梗死提供了可能。2014 年2～8月，我們對骨髓間充質干細胞移植治療心肌梗死豬的作用進行了觀察。

1　材料與方法

1.1實驗動物健康成年本地豬21只，4～5月齡，體質量28～32 (29.5±4.6) kg，由本院實驗動物中心提供，經檢驗為健康合格實驗用動物。

1.2豬骨髓間充質干細胞的分離、培養及鑒定取實驗動物1只給予氯胺酮腹腔注射麻醉，濃碘伏消毒。取豬四肢骨，去除干骺端，暴露骨髓腔，用10 mL培養液沖洗骨髓腔。將所獲骨髓緩慢加入已含Ficoll-Paque分離液3 mL的試管內梯度離心(2 000 r/min、30 min)，吸取富含粒細胞中間界面層，PBS洗滌3次，制成單細胞懸液接種。培養條件為37℃、飽和濕度、5% CO2，培養基為DMEM(含10% FBS、100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素)。3～4 d更換1次培養液，去除未貼壁細胞，至細胞融合時胰酶消化收集細胞、傳代。收集第2代細胞，分別加入造血干細胞標志抗體FITC-CD34和FITC-CD45，間充質干細胞標志抗體PE-CD44、PE-CD29和PECD90，4℃冰箱中孵育30 min，流式細胞儀檢測CD34、CD45、CD44、CD29、CD90。消化收集第3代骨髓間充質干細胞，改用成骨誘導培養液(高糖DMEM、10% FBS、地塞米松1×10－8mol/L、維生素C 50 mg/L、β-磷酸甘油鈉10 mmol/L)，置于37℃、5% CO2的孵箱中培養，堿性磷酸酶染色檢測其向成骨細胞分化情況。

1.3豬心肌梗死模型的制備及分組取20只實驗動物術前禁食12 h，給予3%戊巴比妥鈉溶液麻醉，穿刺股動脈，在動脈造影引導下，直接將球囊栓子推送并定位于靶血管區。采用冠狀動脈血管造影及心電圖監測模型的制備情況。將造模成功的20只豬隨機分為實驗組和對照組各10只。造模后1 h，實驗組動物梗死區選擇3點注射骨髓間充質干細胞0.2 mL，對照組注射生理鹽水0.2 mL。

1.4心功能相關指標檢測實驗動物注射骨髓間充質干細胞或生理鹽水后飼養1個月，應用二維超聲心動圖(標準左室長軸切面及心尖四腔心切面)觀察兩組動物心臟的結構形態及心功能(左室射血分數)。

1.5統計學方法采用SPSS16.0統計軟件。計量資料用珋x±s表示，兩組比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1骨髓間充質干細胞鑒定結果骨髓間充質干細胞培養24 h后少部分細胞開始伸展并貼壁生長，貼壁細胞呈梭形、三角形和多角形，為單個或多個細胞的克隆;培養7 d后細胞增殖迅速，可見集落生成，細胞折光性強。原代培養12～14 d，90%以上細胞融合，融合細胞呈梭形。流式細胞儀檢測第2代細胞發現其不表達CD34、CD45，而表達CD29、CD44、CD90。經成骨誘導分化后，細胞堿性磷酸酶染色陽性，堿性磷酸酶活性部位呈棕黑色。證實分離培養的細胞是骨髓間充質干細胞。

2.2豬心肌梗死模型制備情況冠狀動脈血管造影見豬冠狀動脈供血區阻塞，同時心電圖V1～V3或相關導聯出現ST段弓背上抬及壞死性Q波，證實造模成功。

2.3骨髓間充質干細胞移植對心肌梗死豬的治療效果實驗動物注射骨髓間充質干細胞或生理鹽水后飼養1個月實驗組均存活，對照組死亡1只。二維超聲心動圖檢查結果顯示兩組動物心臟室壁均出現節段性收縮運動障礙，在梗死部位可見室壁運動消失，心肌無收縮，其周圍心肌收縮力減弱，梗死部位與心電圖診斷結果一致;兩組心臟結構比較無明顯差異。實驗組左室射血分數(41.64±5.26) %、對照組為(36.73±4.32) %，兩組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。

3　討論

心肌梗死后，心肌細胞發生壞死、凋亡，數目減少，且無再生能力。因此，心肌細胞缺血壞死后只能由瘢痕替代，而瘢痕會加重心肌損傷，使正常心肌形成反常運動，導致心室結構發生改變，更易發生充血性心力衰竭，最終導致死亡［6］。干細胞具有自我更新能力，可向心肌細胞分化，對心肌梗死有一定的改善作用［7，8］。本實驗采用栓子直接植入法成功建立豬急性心肌梗死模型［9］，采用密度梯度離心及貼壁法分離、純化、培養豬骨髓間充質干細胞，將其直接由心外膜注射至心肌梗死區，發現其對心肌梗死豬心功能有明顯的改善作用，與前人的研究結果相似。分析其原因可能為:①骨髓間充質干細胞在生理條件下能釋放多種細胞因子、細胞活素等來調節基質重塑，減少瘢痕對心肌的損傷，增加梗死心臟的毛細血管密度，從而改善心功能，縮小梗死面積;②骨髓間充質干細胞可通過旁分泌作用間接誘導血管再生，恢復部分心肌的血供;③骨髓間充質干細胞在心臟微環境下分化為心肌樣細胞，且其分化的心肌樣細胞含微管、肌鈣蛋白I和肌球蛋白重鏈，可與宿主細胞發生整合，改善心功能［10～12］。

有研究發現，骨髓間充質干細胞移植在梗死心肌內可存活6個月，并表達心肌細胞和內皮細胞特征性蛋白，但其對整體心臟功能的改善時間短暫，在術后4周時明顯，到術后6個月時消失。本研究細胞移植后僅觀察1個月，因此，有必要對骨髓間充質干細胞的長期療效作進一步研究。

參考文獻:

［1］中華醫學會心血管病學分會，中華心血管病雜志編輯委員會，中國循環雜志編輯委員會.急性心肌梗死診斷和治療指南［J］.中華心血管病雜志，2001，29(12) : 710-725.

［2］曾彬，王艾力，彭小凡，等.骨髓間充質干細胞介導的血紅素氧合酶-1促進大鼠心肌梗死后血管再生［J］.基礎醫學與臨床，2014，34(2) : 145-150.

［3］侯玲玲，曹華，魏國榮，等.人臍血間充質干細胞體外擴增和向神經元樣細胞定向誘導分化的研究［J］.中華血液學雜志，2002，23(8) : 415-419.

［4］艾國平，粟永萍.誘導骨髓間充質干細胞向成骨細胞和成軟骨細胞分化［J］.中國臨床康復，2002，6(18) : 2689-2690.

［5］肖慶忠，李浩威，溫冠媚，等.麝香多肽體外誘導成年大鼠和人骨髓間充質干細胞定向分化為神經元的研究［J］.中國病理生理雜志，2002，18(10) : 1179-1182.

［6］徐瑾，王彬堯，王長謙，等.骨髓間充質干細胞在心肌梗死區的移植和分化對心肌梗死后心力衰竭的影響［J］.心臟雜志，2006，18(2) : 138-142.

［7］張曉芳，季曉平，宋兆峰，等.骨髓間充質干細胞同種移植治療急性心肌梗死的實驗研究［J］.中國心血管病研究雜志，2005，3(8) : 617-619.

［8］劉衛生，舒茂琴，王英杰.骨髓間充質干細胞在心肌梗死犬心肌內分化及對心肌細胞凋亡的影響［J］.中國神經再生研究，2008，12(38) : 7447-7450.

［9］陶四明，郭濤，普順華，等.微創法構建豬急性心肌梗死模型［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2010，14(33) : 6121-6124.

［10］曾俊義，魏云峰，汪泱.誘導骨髓間充質干細胞向心肌細胞分化及相關信號通路的研究進展［J］.心臟雜志，2008，20(5) : 634-637.

［11］齊曉云，楊關林，陳巖，等.骨髓間充質干細胞移植對兔急性心肌梗死后膠原重構的影響［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2009，13(27) : 5247-5251.

［12］李金軼，鐘國強，柯紅紅，等.同種異體骨髓間充質干細胞移植上調急性心肌梗死大鼠Cx43的表達［J］.基礎醫學與臨床，2010，30(4) : 337-342.

·臨床研究·

(收稿日期:2015-03-25)

文章編號:1002-266X(2015) 21-0028-02

文獻標志碼:A

中圖分類號:R542.22

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.21.010