動脈粥樣硬化患者外周血單核細胞中NLRP3 mRNA表達及血漿IL-1β、IL-18水平變化

動脈粥樣硬化患者外周血單核細胞中NLRP3 mRNA表達及血漿IL-1β、IL-18水平變化

周洪琴1，郭晶1，陳鵬2，李蕊1，趙珍1

(1新泰市第二人民醫院，山東新泰271200；2泰山醫學院基礎醫學院)

摘要：目的觀察動脈粥樣硬化患者外周血單核細胞中核苷酸結合寡聚化結構域樣受體3(NLRP3)mRNA的表達情況，及患者血漿IL-1β、IL-18水平變化。方法動脈粥樣硬化患者45例(病例組)，健康查體者42例(對照組)，采集兩組外周靜脈血，淋巴細胞分離液分離單核細胞，real-time PCR法檢測單核細胞中的NLRP3 mRNA。采用ELISA法檢測兩組血漿中的IL-1β、IL-18。分析NLRP3 mRNA表達與IL-1β、IL-18水平的相關性。結果對照組單核細胞中NLRP3 mRNA表達為1，病例組NLRP3 mRNA表達量為對照組的(1.76±0.35)倍，兩組相比，P<0.05。對照組血漿IL-1β、IL-18水平分別為(12.35±3.89)、(25.14±5.67)pg/mL，病例組分別為(17.56±4.66)、(32.81±7.08)pg/mL，兩組血漿IL-1β、IL-18水平比較，P均<0.05。病例組單核細胞中NLRP3 mRNA表達與血漿IL-1β、IL-18水平均呈正相關關系(r分別為0.48、0.53，P均<0.05)。結論動脈粥樣硬化患者外周血單核細胞中NLRP3 mRNA表達上調，血漿IL-1β、IL-18水平升高；NLRP3可能與動脈粥樣硬化的發生發展有關。

關鍵詞：動脈粥樣硬化；單核細胞；核苷酸結合寡聚化結構域樣受體3；白細胞介素1β；白細胞介素18

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.39.017

中圖分類號：R541.4 文獻標志碼：B

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81202979)。

收稿日期：(2015-08-15)

局部及全身炎癥反應在動脈粥樣硬化的發生發展中發揮重要作用[1]。炎性小體是細胞內一類大分子蛋白質復合體[2，3]。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體3(NLRP3)炎性小體可促進IL-1β、IL-18等細胞因子的剪切和活化，引起機體炎癥反應。NLRP3炎性小體在心血管疾病中的作用是當前的研究熱點[4,5]。本研究觀察了動脈粥樣硬化患者外周血單核細胞中NLRP3 mRNA的表達情況及血漿IL-1β、IL-18的水平變化，進一步探討NLRP3炎性小體與動脈粥樣硬化發生發展的關系。

1資料與方法

1.1臨床資料2013年12月~2014年12月泰山醫學院附屬醫院和新泰市第二人民醫院收治的穩定型心絞痛患者45例(病例組)，男25例、女20例，年齡(57.6±7.1)歲，均經超聲檢查確診，并且近48 h內有心絞痛發作至少1次，但無心肌壞死的心肌酶譜改變，同時伴有心電圖ST段壓低或T波改變。選擇健康體檢者42例(對照組)，其中男23例、女19例，年齡(55.2±5.3)歲。兩組性別、年齡差異無統計學意義。

1.2單核細胞中NLRP3 mRNA檢測取兩組外周靜脈血5 mL，肝素鈉抗凝。用淋巴細胞分離液分離外周血單核細胞。按照TRIzol試劑盒說明書提取總RNA，用分光光度計測定RNA濃度。取總RNA 1 μg逆轉錄合成cDNA，-20 ℃保存備用。采用real-time PCR法檢測NLRP3 mRNA。NLRP3上游引物序列為5′-CTTCCTTTCCAGTTTGCTGC-3′，下游引物序列為5′-TCTCGCAGTCCACTTCCTTT-3′，產物長度220 bp；內參GAPDH上游引物序列為5′-CTTCTCTGATGAGGCCCAAG-3′，下游引物序列為5′-G-CAGCAAACTGGAAAGGAAG-3′，產物長度222 bp。PCR總反應體系包含SYBR Green Mix 10 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、cDNA 1 μL，加雙蒸水至20 μL。反應條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共40個循環。每個樣品均作3個復孔，反應結束后作溶解曲線，以2-ΔΔCt進行數據分析。

1.3血漿IL-1β、IL-18檢測采用ELISA法檢測兩組血漿IL-1β、IL-18，按照試劑盒說明書進行操作。

1.4統計學方法采用SPSS16.0軟件進行統計分析。計量資料以±s表示，兩組比較采用t檢驗。采用Pearson相關性分析對NLRP3 mRNA表達與IL-1β、IL-18水平的相關性進行分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1兩組單核細胞中NLRP3 mRNA表達比較設對照組單核細胞中NLRP3 mRNA表達為1，病例組NLRP3 mRNA表達量為對照組的(1.76±0.35)倍，兩組相比，P<0.05。

2.2兩組血漿IL-1β、IL-18水平比較對照組血漿IL-1β、IL-18水平分別為(12.35±3.89)、(25.14±5.67)pg/mL，病例組分別為(17.56±4.66)、(32.81±7.08)pg/mL，兩組血漿IL-1β、IL-18水平比較，P均<0.05。

2.3NLRP3 mRNA表達與IL-1β、IL-18水平的相關性病例組單核細胞中NLRP3 mRNA表達與血漿IL-1β、IL-18水平均呈正相關關系(r分別為0.48、0.53，P均<0.05)。

3討論

NLRP3炎性小體由NLRP3、含C-末端Caspase募集域的凋亡相關斑點樣蛋白(ASC)和Caspase-1相互結合而成。一般情況下NLRP3處于自身抑制狀態，其C端亮氨酸重復序列(LRR)結構域與分子伴侶熱休克蛋白90結合，抑制NLRP3活性[6,7]。當配體與NLRP3的LRR結構域結合后，使得熱休克蛋白90釋放，NLRP3通過核苷酸結合寡聚化結構域(NOD)發生自身寡聚化，使熱蛋白結構域與ASC相互作用，并通過ASC的胱天蛋白酶招募結構域招募并激活Caspase-1，Caspase-1活化后可使IL-1β、IL-18前體變為活性形式，分泌到細胞外從而發揮免疫作用[8~11]。

炎癥反應貫穿于動脈粥樣硬化的發生和發展過程。血脂異常被認為是動脈粥樣硬化發病的始動因素[12~14]。近期研究顯示，膽固醇被內皮細胞及巨噬細胞吞噬攝取后會形成微小膽固醇結晶，膽固醇晶體可激活NLRP3炎性小體，促進IL-1β、IL-18分泌，促動脈粥樣硬化形成[15,16]。

為闡明NLRP3炎性小體是否參與了動脈粥樣硬化的發生發展，我們檢測了動脈粥樣硬化患者及健康人群外周血單核細胞中的NLRP3 mRNA及血漿IL-1β、IL-18。我們發現，病例組單核細胞中NLRP3 mRNA表達升高，血漿IL-1β、IL-18水平也明顯升高；相關性分析結果顯示，病例組NLRP3 mRNA表達與IL-1β、IL-18水平均呈正相關關系。上述研究結果提示NLRP3炎性小體及其誘導產生的IL-1β、IL-18都可能參與了動脈粥樣硬化的進展。這與Satoh等[11]的研究結果一致。

綜上所述，動脈粥樣硬化患者外周血單核細胞中NLRP3 mRNA表達升高，NLRP3/IL-1β、IL-18通路在動脈粥樣硬化發生發展過程中可能發揮重要作用。NLRP3炎性小體的具體調控機制及NLRP3炎性小體與其他炎癥因子的相互作用將成為下一步研究的重點。

參考文獻：

[1] Ross R. Atherosclerosis-an inflammatory disease [J]. N Engl J Med, 1999,340(2):115-26.

[2] Zhou R, Yazdi AS, Menu P, et al. A role for mitochondria in NLRP3 inflammasome activation[J]. Nature, 2011,469(7329):221-225.

[3] Yang CS, Shin DM, Jo EK. The Role of NLR-related Protein 3 Inflammasome in Host Defense and Inflammatory Diseases[J]. Int Neurourol J, 2012,16(1):2-12.

[4] Ozaki E, Campbell M, Doyle SL. Targeting the NLRP3 inflammasome in chronic inflammatory diseases: current perspectives[J]. J Inflamm Res, 2015,8(1):15-27.

[5] Bronner DN, Abuaita BH, Chen X, et al. Endoplasmic reticulum stress activates the inflammasome via NLRP3- and Caspase-2-driven mitochondrial damage[J]. Immunity, 2015,7613(15):320-329.

[6] Tong Y, Ding ZH, Zhan FX, et al.The NLRP3 inflammasome and stroke[J]. Int J Clin Exp Med, 2015,8(4):4787-4794.

[7] Antonopoulos C, Russo HM, El Sanadi C, et al. Caspase-8 as an effector and regulator of NLRP3 inflammasome signaling[J]. J Biol Chem, 2015,290(33):20167-20184.

[8] Butts B, Gary RA, Dunbar SB, et al.The importance of NLRP3 inflammasome in heart failure[J]. J Card Fail, 2015,21(7):586-593.

[9] Lu X, Kakkar V. Inflammasome and atherogenesis[J]. Curr Pharm Des, 2014,20(1):108-124.

[10] Chen Y, Li X, Boini KM, et al. Endothelial Nlrp3 inflammasome activation associated with lysosomal destabilization during coronary arteritis[J]. Biochim Biophys Acta, 2015,1853(2):396-408.

[11] Satoh M, Tabuchi T, Itoh T, et al. NLRP3 inflammasome activation in coronary artery disease: results from prospective and randomized study of treatment with atorvastatin or rosuvastatin[J]. Clin Sci (Lond), 2014,126(3):233-241.

[12] Ehara S, Ueda M, Naruko T, et al. Elevated levels of oxidized low density lipoprotein show a positive relationship with the severity of acute coronary syndromes[J]. Circulation, 2001,103(15):1955-1960.

[13] 丁志祥,錢高潮,張琪.血脈通顆粒對動脈粥樣硬化小鼠外周血單核細胞TLR4、IL-6、TNF-β的影響[J].山東醫藥,2013,53(44):4-7.

[14] Lee SD, Tontonoz P. Liver X receptors at the intersection of lipid metabolism and atherogenesis[J]. Atherosclerosis, 2015,242(1):29-36.

[15] Duewell P, Kono H, Rayner KJ, et al. NLRP3 inflammasomes are required for atherogenesis and activated by cholesterol crystals[J]. Nature, 2010,464(7293):1357-1361.

[16] Rajamaki K, Lappalainen J, Oorni K, et al. Cholesterol crystals activate the NLRP3 inflammasome in human macrophages:a novel link between cholesterolmetabolism and inflammation[J]. PLoS One, 2010,5(7):e11765.