白細(xì)胞介素-12B基因多態(tài)性與原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的相關(guān)性分析

曹玉梅，吳振蘭，宋會會，趙建強(qiáng)，李玉潔，王振明

(1濰坊醫(yī)學(xué)院，山東濰坊261042；2濰坊市人民醫(yī)院)

白細(xì)胞介素-12B基因多態(tài)性與原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的相關(guān)性分析

曹玉梅1，吳振蘭2，宋會會2，趙建強(qiáng)2，李玉潔2，王振明2

(1濰坊醫(yī)學(xué)院，山東濰坊261042；2濰坊市人民醫(yī)院)

目的 分析白細(xì)胞介素-12B(IL-12B)基因啟動子區(qū)多態(tài)性與原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(URSA)的相關(guān)性。方法 URSA患者83例(URSA組)，同期門診體檢健康婦女90例(對照組)，采用RT-PCR法檢測兩組IL-12B基因多態(tài)性。結(jié)果 在IL-12B基因啟動子區(qū)共發(fā)現(xiàn)2個單核苷酸多態(tài)性，即-671G/T和-405G/T，兩組IL-12B基因-671G/T、-405G/T多態(tài)性分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。URSA組-671T/-405G單體型比例(0.65%)高于對照組(0.41%)，P<0.05。結(jié)論 IL-12B基因啟動子區(qū)單體型-671T/-405G基因型可能與URSA發(fā)生有關(guān)。

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)；白細(xì)胞介素-12B基因；單核苷酸多態(tài)性；相關(guān)性分析

原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(URSA)發(fā)病率為1%～3%[1]，具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚。白細(xì)胞介素-12(IL-12)是與免疫功能相關(guān)的細(xì)胞因子，在URSA的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，IL-12B的基因啟動子區(qū)多態(tài)性影響IL-12B轉(zhuǎn)錄，但基因多態(tài)性與URSA相關(guān)性在不同種族不盡相同[2～4]。本研究探討IL-12B基因啟動子區(qū)多態(tài)性與中國北方漢族育齡期婦女URSA的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2013年6月～2014年6月濰坊市人民醫(yī)院住院URSA患者83例(URSA組)，年齡21～41(30.43±4.34)歲，均根據(jù)臨床癥狀、現(xiàn)病史、既往史、家族史、查體及輔助檢查等多項指標(biāo)評定后確診。另選同期門診體檢健康婦女90例作為對照組，年齡25～43(31.26±3.86)歲，妊娠均≥2次，無不良妊娠史。兩組年齡具有可比性；均為中國漢族，相互間無血緣關(guān)系。

1.2 方法

1.2.1 IL-12B基因多態(tài)性檢測 采用RT-PCR法。①兩組分別取外周靜脈血3 mL，EDTA抗凝，提取DNA。②引物設(shè)計與合成根據(jù)NCBI發(fā)表的IL-12B基因序列(GeneBank ID AY008847)，第1對引物上游：5′-TGAGGCTCAGCGAGTAACTT-3′，下游：5′-AGACCACACCTTGAGAACCA-3′，擴(kuò)增長度740 bp；第2對引物上游：5′-TGCTGAATCAGACACTCTGG-3′，下游：5′-ACCAACTGCTGGTGACACAT-3′，擴(kuò)增長度830 bp。引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。③ PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系25 μL；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min、94 ℃變性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s，共循環(huán)35次；72 ℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。④隨機(jī)選取部分樣品的PCR產(chǎn)物，進(jìn)行序列測定(南京金斯瑞生物科技有限公司)，確定-671 G/T和-405 G/T位點的基因型，同時對酶切結(jié)果進(jìn)行驗證，以保證結(jié)果的可靠性。

1.2.2 統(tǒng)計學(xué)方法 采用擬合優(yōu)度χ2檢驗，檢測L-12B基因啟動子區(qū)位點基因型頻率、等位基因頻率是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。采用在線軟件平臺SHEsis 分析單體型數(shù)據(jù)[5]。采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

IL-12B基因啟動子區(qū)位點的基因型頻率符合Hardy-Weinberg平衡定律。在IL-12B基因的啟動子區(qū)共發(fā)現(xiàn)2個功能單核苷酸，即-671G/T和-405G/T，兩組IL-12B基因-671G/T、-405G/T多態(tài)性分布見表1、2。-671G/T和-405G/T等位基因頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律。兩組-671G/T和-405G/T構(gòu)成的3種單體型比較見表3。

3 討論

IL-12作為一種炎性細(xì)胞因子，是連接早期非特異免疫反應(yīng)和繼發(fā)抗原特異性免疫反應(yīng)的橋梁，主要由抗原激活的單核/巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞等抗原遞呈細(xì)胞產(chǎn)生，通過調(diào)節(jié)Th1、Th2比例，在淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫過程中發(fā)揮重要作用[6,7]。IL-12是由IL-12A(P30)和IL-12B(P40)兩個亞基組成。IL-12A(P30)基因易感性研究相對較少。IL-12B具有基因多態(tài)性，國內(nèi)外的許多研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，IL-12B啟動子、rs321309、外顯子5′、3′UTR基因多態(tài)性與疾病相關(guān)。如Morahan等[8]認(rèn)為，3′UTR等位基因高表達(dá)與結(jié)核病相關(guān)；周林等[9]認(rèn)為，rs321309可能與寧夏人群強(qiáng)直性脊柱炎患病風(fēng)險有關(guān)聯(lián)；張雄等[10]認(rèn)為，3′UTR(A>C)多態(tài)性可能是亞洲人群宮頸癌和鼻咽癌易患性增加的危險因素之一。

正常妊娠時Th1/Th2免疫反應(yīng)保持平衡，母胎界面以Th2型細(xì)胞因子占主導(dǎo)地位，發(fā)揮免疫營養(yǎng)作用。當(dāng)Th1/Th2比值變化向Th1偏離時，則可能損傷胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞及胎兒，導(dǎo)致URSA患者Th1型因子分泌IL-2、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、干擾素γ(IFN-γ)等，介導(dǎo)細(xì)胞免疫、炎癥反應(yīng)，對胚胎生長發(fā)育不利。而IFN-γ與IL-12存在正反饋循環(huán)，IFN-γ及促進(jìn)IFN-γ增加的因素都能促進(jìn)IL-12產(chǎn)生，反之，IL-12增加亦可促進(jìn)IFN-γ的產(chǎn)生。所以，IL-12的表達(dá)可間接導(dǎo)致復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生。Wilson等[11]發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者血清IL-12水平明顯高于正常未孕婦女。

URSA作為一種多基因遺傳病，其遺傳易感性可能是由多個功能單核苷酸的遺傳變異所決定，并受環(huán)境因素影響。對于多基因疾病易感基因的鑒定，雖然目前還沒有最好的方法，但通過連鎖分析結(jié)合關(guān)聯(lián)分析及生物學(xué)功能研究，找到了一些多基因疾病的易感基因，如IL-23R是強(qiáng)直性脊柱炎的易感基因[12]、miR-499基因是高度宮頸上皮內(nèi)瘤變的易感基因[13]、ADAM33基因是慢性阻塞性肺疾病的易感基因[14]。

本研究選取中國漢族URSA患者為研究對象，在IL-12B基因的啟動子區(qū)共發(fā)現(xiàn)2個功能單核苷酸，即-671G/T和-405G/T，URSA組、對照組IL-12B基因-671G/T、-405G/T多態(tài)性分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，URSA組-671T/-405G單體型比例多對照組；提示IL-12B基因啟動子區(qū)的-671G/T、-405G/T基因型與URSA發(fā)生無關(guān)聯(lián)，單體型-671G/-405G可能與URSA的遺傳易感性有關(guān)，但其在URSA易感性中的作用和機(jī)制尚需進(jìn)一步研究證實。

[1] Stirrat GM. Recurrent miscarrage Ⅱ: clinical associations, causes and management[J]. Lancet, 1990,336(8717):728-733.

[2] Wang ZC, Yunis EJ, De los Santos MJ, et al. T helper 1-type immunity to trophoblast antigens in women with a history of recurrent pregnancy loss is associated with polymorphism of the IL-1b promoter region[J]. Genes Immun, 2002,3(1):38-42.

[3] Ma X, Xu LJ, Wang J, et al. Association of IL-1β and IL-6 gene polymorphisms with recurrent spontaneous abortion in a Chinese Han population[J]. Int J Immunogenet, 2012,39(1):15-19.

[4] Agrawal S, Parveen F, Faridi RM, et al. Interleukin-1 gene cluster variants and recurrent pregnancy loss among North Indian women: retrospective study and meta-analysis[J]. Reprod Biomed Online, 2012,24(3):342-351.

[5] Barrett JC, Fry B, Maller J, et al. Haploview: analysis and visualization of LD and hapllotype maps[J]. Bioinformatics, 2005,21(2):263-265.

[6] Zhang W, Collins A, Maniatis N, et al. Properties of linkage disequilibrium (LD) maps[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002,99(26):17004-17007.

[7] 華東,王豐,吳小紅,等.乳腺癌患者血清IL-12水平變化及臨床意義[J].山東醫(yī)藥,2004,44(36):34.

[8] Morahan G, Kaur G, Singh M, et al. Association of variants in the IL12 Bgene with leprosy and tuberculoss[J]. Tissue Antigens, 2007,69(1):234-236.

[9] 周林,張建佚,劉英,等.IL-12B基因多態(tài)性與寧夏人群強(qiáng)直性脊柱炎患病風(fēng)險的新關(guān)聯(lián)[J].國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2013,34(11):1372-1375.

[10] 張雄,金粉淑,張立國,等.白介素12 基因多態(tài)性與惡性腫瘤易患性的病例對照研究Meta 分析[J].中國全科醫(yī)學(xué),2013,16(10):3533-3538.

[11] Wilson R, Jenkins C, Miller H, et al. Abnormal cytokine levels in no-pregnant women with a history of recurrent miscarriage[J]. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol, 2004,115(1):51-54.

[12] Karaderi T, Harvey D, Farrar C, et al. Association between the interleukin 23receptor and ankylosing spondulitis is confirmed by a new UKcase-control study and meta-analysis of published series [J]. Rheumatology (Oxford), 2009,48(4):386-389.

[13] 董一善,繆娟,傅士龍,等.miR-499基因多態(tài)性與高度宮頸上皮內(nèi)瘤變易感性的關(guān)系[J].江蘇醫(yī)藥,2014,40(4):414-416.

[14] 遲翔宇,肖偉,王建平,等.慢性阻塞性肺疾病患者ADAM33基因單核苷酸多態(tài)性的研究[J].山東醫(yī)藥,2011,51(49):1-3.

吳振蘭，E-mail: wuzhenlan.wf@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2015.12.025

R714.21

B

1002-266X(2015)12-0064-02

2014-08-21)