子癇前期患者胎盤及臍帶組織IDO、MIF表達變化及意義

張靜，楊再全，李霞，姚曉玲，田園，于彩霞

(1滄州醫學高等專科學校，河北滄州061001；2滄州市傳染病醫院；3滄州市人民醫院)

子癇前期患者胎盤及臍帶組織IDO、MIF表達變化及意義

張靜1，楊再全2，李霞3，姚曉玲3，田園1，于彩霞1

(1滄州醫學高等專科學校，河北滄州061001；2滄州市傳染病醫院；3滄州市人民醫院)

目的 觀察子癇前期(PE)患者胎盤及臍帶組織吲哚胺2，3-雙加氧酶(IDO)、巨噬細胞移動抑制因子(MIF)的表達變化，并探討其意義。方法 PE患者66例，其中輕度32例(輕度組)、重度34例(重度組)，同期健康晚孕婦女42例作為對照組。分別采用RT-PCR法和Western blot法檢測胎盤、臍帶組織中IDO、MIF mRNA和蛋白，用彩色超聲多普勒診斷儀檢測各組產前胎兒的臍動脈血流阻力指數(RI)，記錄新生兒體質量。結果 重度組、輕度組、對照組胎盤、臍帶組織IDO mRNA及蛋白相對表達均逐漸升高，MIF mRNA及蛋白相對表達、RI均逐漸降低；組間兩兩比較，P均<0.01。重度組新生兒體質量均低于輕度組和對照組，P均<0.01。PE患者中，胎盤、臍帶組織IDO、MIF mRNA相對表達均呈負相關(r分別為-0.468、-0.455)，P均<0.01；胎盤、臍帶組織IDO mRNA表達水平與RI均呈負相關(r分別為-0.317、-0.526)，與新生兒體質量均呈正相關(r分別為0.398、0.461)，P均<0.01；胎盤、臍帶組織MIF mRNA表達水平與RI均呈正相關(r分別為0.393、0.502)，與新生兒體質量均呈負相關(r分別為-0.302、-0.431)，P均<0.01。結論 PE患者胎盤及臍帶組織中IDO表達降低、MIF表達升高，與胎兒RI升高和新生兒體質量降低有關，可能參與PE的發病。

子癇前期；吲哚胺2，3-雙加氧酶；巨噬細胞移動抑制因子；炎癥因子；妊娠

子癇前期(PE)是妊娠特發性疾病，長期以來因其發病機制不明且缺乏有效治療方法而成為產科領域的一大困擾[1]。其特征性病理改變是血管內皮細胞損傷及功能障礙，而過度炎癥刺激及氧化應激是導致血管內皮細胞損傷的直接原因。吲哚胺2，3-雙加氧酶(IDO)是機體重要的內源性保護體系，其在母胎界面的適度表達是妊娠維持的保障[2]。巨噬細胞移動抑制因子(MIF)作為一種與炎癥密切相關的前驅因子，在PE的發病過程中發揮重要調節作用[3]。本研究觀察正常晚孕婦女及PE患者胎盤、臍帶組織中IDO、MIF的表達變化，并探討其意義。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2011年4月～2013年8月于滄州市人民醫院產科住院分娩的PE患者66例，其中輕度32例(輕度組)、重度34例(重度組)，PE診斷標準及分類依據參照第8版《婦產科學》。選擇同期健康晚孕婦女42例作為對照組，3組均為首次妊娠、單胎，均除外其他內外科并發癥，無煙酒等不良嗜好，均以腰麻下剖宮產術結束分娩。輕度組年齡(26.8±4.4)歲、孕(37.9±0.6)周，重度組分別為(27.1±3.7)歲、(37.3±1.7)周，對照組分別為(26.0±3.5)歲、(38.0±0.5)周。各組年齡、孕周均具有可比性(P均>0.05)。

1.2 材料 兔抗人IDO多克隆抗體及兔抗人MIF多克隆抗體(美國分子標記公司)，山羊抗兔IgG(中杉金橋)，總RNA極速抽提試劑盒(上海飛捷)，RT-PCR試劑盒(上海生工)，TC-XP-G基因擴增儀(杭州博日)，GIS 1D(Ver.4.0)圖像分析軟件(上海天能)。

1.3 方法

1.3.1 標本處理方法 胎盤娩出后20 min內，無菌狀態下取胎盤和臍帶組織各約1 g，冰上生理鹽水漂洗后分別置于1.5 mL無菌離心管中，液氮罐轉運至-70 ℃冰箱保存。

1.3.2 胎盤和臍帶組織IDO、MIF mRNA檢測 采用RT-PCR法。提取胎盤及臍帶組織總RNA，嚴格參照試劑盒說明書操作。基因序列從GenBank獲得，Primer Premier5.0軟件設計引物序列，上海生工合成。IDO上游引物：5′-TTTGCTAAAGGCGCTGTTGG-3′，下游引物5′-CCTTCATACACCAGACCGTCTGA-3′，擴增長度168 bp；MIF上游引物：5′-GCCCGGACAGGGTCTACA-3′，下游引物：5′-CTTAGGCGAA-GGTGGAGTTGTT-3′，擴增長度125 bp；以GADPH為內參，上游引物：5′-TCATGGGTGTGAACCATGAGAA-3′，下游引物：5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′，擴增長度146 bp。擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共35個循環；72 ℃延伸5 min；4 ℃ 5 min。取5 μL反應產物，15 g/L瓊脂糖凝膠進行電泳，結果用計算機掃描分析，IDO、MIF mRNA相對表達以目的基因與內參基因擴增條帶的實際灰度值的比值表示。

1.3.3 胎盤和臍帶組織IDO、MIF蛋白檢測 采用Western blot法。取-70 ℃保存的各組胎盤和臍帶組織樣品適量，液氮下研磨后移入預冷的勻漿管；加入等比例組織裂解液，冰浴中勻漿；將勻漿液轉移至1.5 mL離心管中，4 ℃ 10 000 r/min離心約10 min；小心吸取上清液，分裝保存至新離心管中即為蛋白樣本，采用蛋白濃度測定試劑盒分別檢測各樣本中總蛋白濃度。以Action作為內參，進行電泳、轉膜，牛奶封閉、過夜。加入一抗、二抗，顯影，曝光，計算機掃描及分析系統檢測各條帶平均灰度值(A)，目的蛋白的相對表達量以目的條帶與內參的A值比表示。

1.3.4 其他觀察指標 各組均于產前2 d采用飛利浦iU Elite全身彩色超聲多普勒診斷儀(探頭頻率5.0 MHz)測定胎兒臍動脈血流阻力指數(RI)。記錄新生兒的體質量。

2 結果

2.1 各組胎盤、臍帶組織IDO、MIF mRNA相對表達量比較 見表1。

2.2 各組胎盤、臍帶組織IDO、MIF蛋白相對表達量比較 見表2。

2.3 各組RI及新生兒體質量比較 見表3。

2.4 各指標相關性分析結果 PE患者中，胎盤、臍帶組織IDO、MIF mRNA相對表達均呈負相關(r分別為-0.468、-0.455)，P均<0.01；胎盤、臍帶組織IDO mRNA表達水平與RI均呈負相關(r分別為-0.317、-0.526)，與新生兒體質量均呈正相關(r分別為0.398、0.461)，P均<0.01；胎盤及臍帶組織MIF mRNA表達水平與RI均呈正相關(r分別為0.393、0.502)，與新生兒體質量均呈負相關(r分別為-0.302、-0.431)，P均<0.01。

注：與對照組同一組織比較，*P<0.01；與輕度組同一組織比較，#P<0.01。

注：與對照組同一組織比較，*P<0.01；與輕度組同一組織比較，#P<0.01。

注：與對照組比較，*P<0.01；與輕度組比較，#P<0.01。

3 討論

PE是妊娠期特有疾病，其特征性病理改變為血管內皮細胞損傷和功能障礙，而過度炎癥刺激和氧化應激是導致內皮細胞損傷的直接原因，但刺激因子的來源及其調控機制至今未明。研究發現，PE患者血清可損傷體外培養的人臍靜脈內皮細胞[4]，而產后這一作用迅速消失。因此，多數學者認為其損傷來源是一種急性短期應激反應，考慮與胎盤有關。

IDO是一種含亞鐵血紅素的單體蛋白，相對分子量42 kD，是肝臟以外催化Trp沿犬尿酸途徑分解代謝的惟一限速酶。其主要由外周血單核/巨噬細胞和胎盤滋養細胞分泌，參與機體抗炎、抗感染及抗氧自由基等多種病理生理過程。正常情況下，體內IDO呈低水平表達；在受到致炎因子及氧化應激刺激時，IDO的表達升高，消耗局部微環境中的Trp及氧自由基，發揮清除氧自由基、抗炎及減輕炎癥損傷的作用[5]，是人體重要的內源性保護體系之一。器官移植領域的大量研究證實，IDO可通過促使局部環境中Trp減少和犬尿酸增多來抑制T細胞增殖、促進T細胞凋亡，參與并誘導同種異體移植免疫耐受、降低排斥反應[6]。有關流產的多項研究也表明，正常的IDO表達及活性是妊娠得以維持的必要保障，其在母胎界面的表達減少是導致胎兒流失的高危因素[7]。而PE具有與流產相類似的免疫機制，且使用IDO抑制劑后，正常妊娠小鼠出現了類似PE的表現[8]。因此推測，IDO在母胎界面的表達變化與PE的發病有關，但其在母胎界面的精確定位報道不一，調節機制仍未明確。近年來有關PE發病機制的研究表明，系統性的炎癥反應是PE發病的中心環節[9]。MIF作為炎癥反應的前驅因子，主要由單核/巨噬細胞及活化的T細胞分泌，并儲備于胞質中。當機體受到應激刺激時，MIF可迅速分泌出胞，吸引巨噬細胞向炎癥部位移動、聚集，并抑制其游走，增強巨噬細胞的吞噬功能。同時MIF可誘導巨噬細胞分泌多種致炎因子，如TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6等[10]。已知IFN-γ是最主要的IDO激活物[11]，TNF-α、脂多糖(LPS)及IL-1等致炎因子可增強IFN-γ對IDO的激活作用。因此推測，IDO及MIF的表達變化可能在PE的發病過程中發揮重要作用。

在前期的研究中發現，IDO蛋白表達定位于胎盤滋養細胞、血管內皮細胞及臍血管平滑肌細胞胞質中，間質也有少量表達，MIF蛋白與其具有共定位現象。本研究結果顯示，PE患者IDO mRNA及蛋白表達降低，且隨PE病情加重而降低，MIF則與之相反，二者呈負相關。推測可能由于正常妊娠為輕度炎癥反應， MIF分泌較少，聚集巨噬細胞及上調炎癥因子的表達有限，因而促進IFN-γ對IDO的激活作用誘導IDO表達升高，消耗局部微環境中Trp及氧自由基，發揮局部抗炎及抗氧化等保護作用維持妊娠；而PE由于存在過度炎癥反應[9]，刺激大量儲備型MIF迅速分泌出胞，體內致炎因子及氧自由基短時間內迅速增加，導致局部IDO過度消耗，局部免疫保護缺失，血管內皮細胞損傷加重，最終導致PE的發生。但這一推測仍待進一步的驗證。前期的研究結果顯示，臍血管中膜平滑肌細胞MIF蛋白表達隨PE病情的加重而升高，推測與MIF上調前列腺素E2合成及縮血管作用加強有關[12]。

本研究同時發現，PE患者伴隨低體質量兒出生，臨床監測RI升高；且PE患者IDO mRNA及蛋白表達與RI均呈負相關、與新生兒體質量均呈正相關，而MIF則與之相反。說明RI可作為臨床監測胎兒發育情況、評判PE病情嚴重程度的敏感指標，且操作較簡便。因此，PE患者胎盤及臍帶組織中IDO表達降低、MIF表達升高，與胎兒RI升高和新生兒體質量降低有關，可能參與PE的發病，臨床上要加強對胎兒RI的監測。今后的研究將進一步深入探討IDO及MIF的調控機制，有助于明確PE的發病機理、研究防治措施，以及開發以IDO及MIF為靶點[13]的有效治療藥物等。

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河北省高等學校科學技術研究青年基金資助項目(QN20132002)。

張靜，E-mail: 18031793397@163.com

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R714.244

B

1002-266X(2015)12-0061-03

2014-10-17)