BMSCs-BMP2-煅燒牛骨復合物的制作及其在兔尺骨骨缺損修復中的應用

張彬，湛梅圣，趙玉璽，王萬垠，楊建強，沈建強，劉運華，唐金兵，李彥國，吳璇

(棗陽市第一人民醫院，湖北棗陽441200)

BMSCs-BMP2-煅燒牛骨復合物的制作及其在兔尺骨骨缺損修復中的應用

張彬，湛梅圣，趙玉璽，王萬垠，楊建強，沈建強，劉運華，唐金兵，李彥國，吳璇

(棗陽市第一人民醫院，湖北棗陽441200)

目的 制作兔骨髓間充質干細胞(BMSCs)-骨形態蛋白2(BMP2)-煅燒牛骨復合物，并觀察其在兔尺骨骨缺損修復中的應用。方法 將兔BMSCs分離、培養及成骨誘導后，接種于BMP2-煅燒牛骨復合物，掃描電鏡下觀察復合情況。將54只新西蘭大白兔隨機分為觀察組、對照組、空白組各18只，于無菌條件下造成右側尺骨中段10 mm長缺損。觀察組植入BMSCs-BMP2-煅燒牛骨復合物，對照組植入BMP2-煅燒牛骨復合物，空白組不植入任何材料，術后均不做任何內外固定。各組術后4、8、12周每組隨機處死6只，分別行骨缺損處的放射學和組織學檢查。結果 成骨誘導后的BMSCs均勻分布在煅燒骨表面及孔洞內，與煅燒骨表面貼附緊密，細胞呈圓形，表面光滑，胞體較大，直徑15 μm。隨著術后時間的延長，觀察組和對照組Lane-Sandhu放射學評分、組織學評分均逐漸升高，P均<0.05；空白組無變化，P均>0.05。術后4、8、12周，觀察組和對照組Lane-Sandhu放射學評分、組織學評分均高于空白組，觀察組升高更明顯，P均<0.05。結論 BMSCs能夠較好地與BMP2-煅燒牛骨復合物進行體外復合培養，BMSCs-BMP2-煅燒牛骨復合物植入有助于兔尺骨骨缺損的修復。

骨髓間充質干細胞；骨形態蛋白2；煅燒牛骨；骨缺損；兔

治療骨缺損最理想的材料是自體骨，但自體骨來源有限，取骨增加患者痛苦。骨組織工程學的提出為這一難題的解決提出了新思路，體外培養的骨髓間充質干細胞(BMSCs)在特定的誘導條件下可定向分化為具有典型表型特征的成骨細胞[1]。誘導后的BMSCs可與合適的載體復合[2]，而煅燒牛松質骨具有良好的組織相容性和可靠的生物安全性，孔隙率高有利于成骨細胞的長大和分化，是一種理想的生物支架材料[3]。骨形態蛋白2(BMP2)能夠極好地模擬天然骨基質促發及指導礦化功能，在局部形成偏酸環境，促進局部鈣磷沉積、成核和生物自組裝礦化[4,5]。2013年1月～2014年7月，我們制作了BMSCs-BMP2-煅燒牛骨復合物，并用于修復兔尺骨骨缺損，取得了較好效果。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 4月齡新西蘭大白兔64只(華中科技大學同濟醫學院動物實驗中心),雌雄不限,體質量2.0～2.5 kg。DulbeccoMEM(DMEM)培養基(美國HyClone公司)，Percoll細胞分離液(美國Amshan-Pharmacia公司)，胎牛血清(FBS,美國Gibco公司)，四甲基噻唑藍(MTT,美國Gibco公司)，麥胚凝集素(Sigma公司)。BMP2-煅燒牛骨復合物(華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院骨疾病研究所)，SW-CJ-LF凈化工作臺(蘇州安泰公司)，細胞培養板(德國葛萊娜第一生化股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 兔BMSCs的分離、培養和成骨誘導 取新西蘭大白兔10只，采用全骨髓法離心分離兔股骨骨髓基質細胞。以3×106/mL接種至100 mL培養瓶，加入基礎培養基(含10%小牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素)，置于37 ℃、5% CO2的飽和濕度孵育箱內孵育。待細胞長滿單層后，0.25%胰蛋白酶進行1∶4消化傳代，接種密度為2×105/mL,繼續用誘導培養基(含10×103mol/L的β-甘油磷酸鈉、50 mg/L的L-抗壞血酸、1×10-8mol/L的地塞米松)培養。成骨誘導3周后行改良鈣鈷法堿性磷酸酶(ALP)染色和鈣化結節茜素紅染色，評估成骨誘導效果。ALP染色：取第3代細胞爬片,采用改良鈣鈷法ALP染色,甲基綠復染。鈣化結節茜素紅染色：取第3代細胞爬片,形成鈣化結節后取出,95%乙醇固定后,0.1%茜素紅-Tris-HCl漂染30 min。將已形成鈣化結節的細胞爬片,加入100 mg/L四環素,培養30 min后,更換新鮮培養基,繼續培養30 min，PBS液漂洗2次，95%乙醇固定，在反射熒光顯微鏡下觀察。

1.2.2 BMSCs-BMP2-煅燒牛骨復合物的制作 ddH2O沖洗BMP2-煅燒牛骨復合物,自然干燥后環氧乙烷滅菌，置于6孔培養板中。加入DMEM培養液浸泡過夜,吸出DMEM培養液備用。取成骨誘導3周后兔BMSCs,經消化、離心、重懸后，用成骨誘導培養基計數細胞濃度為1×105/mL,直接接種到備用的BMP2-煅燒牛骨復合物上,置于37 ℃、5% CO2條件下培養2 h。將復合物翻面再次接種細胞,每次接種盡量使細胞充分滲進BMP2-煅燒牛骨復合物中，光鏡下觀察復合情況。

1.2.3 BMSCs-BMP2-煅燒牛骨復合物的應用

1.2.3.1 造模與分組處理 將54只新西蘭大白兔隨機分為觀察組、對照組、空白組各18只，參照鄭啟新、段智霞等[3,5]的方法，于無菌條件下造成右側尺骨中段10 mm長缺損。造模完成后，觀察組立即植入BMSCs-BMP2-煅燒牛骨復合物，對照組植入BMP2-煅燒牛骨復合物，空白組不植入任何材料，術后均不做任何內外固定。

1.2.3.2 骨缺損修復情況觀察 各組術后4、8、12周隨機處死6只新西蘭兔，分別進行放射學和組織學檢查。放射學檢查：對兔骨缺損修復肢行X線攝片，觀察其骨缺損修復情況，并進行Lane-Sandhu放射學評分。組織學檢查：放射學檢查完成后，在麻醉狀態下處死動物，立即以尺骨骨缺損部位為中心取約3 cm不含軟組織的完整尺骨，4%甲醛固定24 h，依次進行脫鈣、脫水、石蠟包埋切片及HE染色處理，光鏡下觀察，并進行Lane-Sandhu組織學評分。

2 結果

2.1 BMSCs-BMP2-煅燒牛骨復合物的制作效果

2.1.1 細胞成骨能力 光鏡下ALP染色的細胞胞質內見大量黑色或褐色顆粒沉淀(見插頁Ⅰ圖1A),鈣化結節茜素紅染色顯示較多深紅色鈣化結節(見插頁Ⅰ圖1B)；反射熒光顯微鏡下四環素熒光染色,見鈣化結節呈強烈的金黃色熒光改變(見插頁Ⅰ圖1C) 。

2.1.2 細胞復合情況 成骨誘導后的BMSCs均勻分布在煅燒骨表面及孔洞內,與煅燒骨表面貼附緊密,細胞呈圓形,表面光滑,胞體較大,直徑15 μm。

2.2 BMSCs-BMP2-煅燒牛骨復合物修復骨缺損效果

2.2.1 放射學檢查結果 觀察組術后4周，骨缺損處有新生骨，缺損界面模糊縮小，可見均勻的骨痂影，出現不規則密度降低區；術后8周，缺損區界線模糊，有較多密度增高的骨痂陰影，與骨斷端融合界限不清，移植骨部分吸收，與骨缺損區連接模糊明顯縮??；術后12周，新骨充滿整個缺損區，高密度的阻射影均勻一致，骨斷端與缺損區融合，髓腔再通，已接近正常骨組織。對照組術后4周，骨缺損處有少量骨癡形成，骨界線模糊，相對變化不明顯；術后8周，缺損處有所縮小，與4周時比較，變化不明顯；術后12周，缺損處有大量新骨形成，缺損處明顯填充，但未完全愈合?？瞻捉M術后4、8、12周均無明顯變化，骨缺損區仍然存在。各組術后4、8、12周Lane-Sandhu放射學評分比較，見表1。

注：與空白組比較，*P<0.05；與對照組比較，#P<0.05；與同組術后4周比較，△P<0.05；與同組術后8周比較，○P<0.05。

2.2.2 組織學檢查結果 觀察組術后4周，移植復合物內開始有新生微血管生成，內部孔隙可見類基質沉積,含胞質豐富的成骨細胞；術后8周，可見骨小梁增粗、變大,新生成骨細胞增生活躍,編織骨基本改建為板層骨,可見哈弗管結構；術后12周，移植區域出現大量成熟骨結構,骨皮質連續,缺損區域骨結構與正常骨結構大致相同, 破骨細胞增生活躍，髓腔通暢。對照組術后4周，可見骨小梁不整齊伴骨基質生成,其邊緣的成骨細胞多呈單層增生；術后8周，可見大量的骨小梁排列不規則,少量板層骨形成,成骨細胞增生活躍,類骨組織轉為編織骨；術后12周，可見大量條索狀板層骨形成伴編織骨,骨細胞排列整齊,骨小梁較前期粗大?？瞻捉M術后4周，可見活躍的成纖維細胞,炎癥細胞浸潤伴結締組織增生,散在的骨小梁生成；術后8周，可見明顯的炎性反應,骨小梁生成較前成熟,其周圍大量活躍的成纖維細胞；術后12周，可見纖維結締組織充填缺損區,沒有成骨表現。各組術后4、8、12周Lane-Sandhu組織學評分比較，見表2。

注：與空白組比較，*P<0.05；與對照組比較，#P<0.05；與同組術后4周比較，△P<0.05；與同組術后8周比較，○P<0.05。

3 討論

目前的研究認為,骨缺損修復的基本條件主要包括適宜的種子細胞、支架材料及可用的細胞因子[6]。適宜的種子細胞是人工植骨材料進行修復的基礎， BMSCs作為骨組織工程中首選的種子細胞,具有取材方便、增殖能力和成骨能力強、免疫原性弱等優點[7]。BMSCs在體外、體內均有向多種間質細胞譜系分化的能力，因此在目前骨組織工程中應用非常普遍[8]。BMSCs在成人骨髓中占有核細胞的0.000 1%～0.01%，所以需要經體外培養分離擴增，才能滿足需要[9，10]。本研究從兔股骨中分離出BMSCs,經過分離、培養、純化及體外誘導，對誘導分化后的成骨細胞進行改良鈣鈷法ALP染色和鈣化結節茜素紅染色鑒定成骨的性能,初步建立了體外大量獲取成骨能力肯定的骨組織工程種子細胞的一種有效方法,為后期骨缺損的再生性修復提供前期研究基礎。

BMPs廣泛存在于動物骨豁、牙齒中，是一類能夠提供間充質細胞向成骨細胞分化的始發信號的低分子糖蛋白,主要是誘導未分化的間充質細胞和成骨細胞的前體細胞向成骨細胞發展[11，12],其中BMP2的誘導成骨作用是BMPs家族中最強的[13，14]。煅燒骨是一種以羥基磷灰石為主要成分的生物材料，通過煅燒可將骨中的全部有機物氧化清除，徹底消除異種抗原，同時還能保留動物骨原有的無機鹽骨架并形成高度多孔結構，以適合成骨細胞移行并快速修復骨缺損。鄭啟新等[3]研究表明, 煅燒牛松質骨具有一定的強度,孔徑合適, 微孔互相連通, 有可靠的生物安全性, 可作為植骨材料。臨床研究表明，煅燒骨作為支架材料復合鋅離子在動物骨缺損修復中取得了滿意療效[15]。

本研究將BMSCs和BMP2-煅燒牛骨復合物進行體外復合培養，能夠更好地彌補單一元素應用受到的限制，發揮種子細胞、細胞因子、支架材料的協同作用，更好地適合微血管、肉芽纖維組織的長入，以及骨與軟骨組織的分化形成，并可促進支架材料的吸收降解。本研究結果表明，隨著術后時間的延長，觀察組和對照組Lane-Sandhu放射學評分、組織學評分均逐漸升高(P均<0.05)；術后4、8、12周，觀察組和對照組Lane-Sandhu放射學評分、組織學評分均高于空白組，觀察組升高更明顯(P均<0.05)。放射學和組織學檢查表明，術后12周，觀察組骨斷端與缺損區融合，髓腔再通，已接近正常骨組織；而對照組未完全愈合，空白組沒有成骨表現，骨缺損區仍然存在。本研究初步證實了BMSCs-BMP2-煅燒牛骨復合物具有良好的骨缺損修復效果，為臨床應用提供了理論基礎和實驗依據，為骨修復材料的研制提供了新的思路。

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Fabrication of BMSCs/BMP-2/calcined bone complex and its application in the repair of bone defect of rabbit ulna

ZHANGBin,ZHANMei-sheng,ZHAOYu-xi,WANGWan-yin,YANGJian-qiang,SHENJian-qiang,LIUYun-hua,TANGJin-bing,LIYan-guo,WUXuan

(TheFirstPeople'sHospitalofZaoyang,Zaoyang441200,China)

Objective To make the rabbit bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs)/bone morphogenetic protein 2 (BMP2)/calcined bone complex, and to observe its application in the repair of bone defect of rabbit ulna. Methods After the isolation, culture and osteogenic induction of rabbit BMSCs, we inoculated on BMP2/calcined bone complex, and observed the compound situation under scanning electron microscope. Fifty-four New Zealand white rabbits were randomly divided into the experimental group, control group, and blank group with 18 rats in each group. Under the sterile conditions, 10 mm defect of the right middle ulna was made. The experimental group was implanted BMSCs/BMP2/calcined bone complexes, while the control group was implanted BMP2/calcined bone complexes, and the blank group without any implantation. After the operation, we did not make any internal and external fixation. After operation 4, 8, and 12 weeks, 6 rabbits in each group were randomly sacrificed, and the radiological and histological examinations of the bone defects were conducted. Results The BMSCs cells after the osteogenic induction uniformly distributed in the bone surface and hole, and calcined bone surface attached closely, cells were round with smooth surface, large cell body and the diameter of 15 μm. With the extension of time, the Lane-Sandhu radiological score and histological score of the experimental group and the control group were increased gradually (allP<0.05); the blank group had no change (P>0.05). Four, eight and twelve weeks after implantation, the Lane-Sandhu radiological score and histological score of the experimental group and the control group were higher than those of the control group, and the experimental group increased more significantly (allP<0.05). Conclusion BMSCs can co-culture with BMP2/calcined bone complexes better in vitro, and the implantation of BMSCs/BMP2/calcined bone complexes help the repair of rabbit ulna bone defect.

bone marrow mesenchymal stem cells; bone morphogenetic protein 2; calcined bone; bone defect; rabbits

湖北省衛生廳科研指導性項目 (JX6C-44)。

張彬(1970-)，男，副主任醫師，研究方向為骨科基礎與臨床。E-mail: 13972058889@139.com

趙玉璽(1984-)，男，主治醫師，研究方向為骨與關節損傷。E-mail: zyx8023wx@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2015.12.005

R318.08

A

1002-266X(2015)12-0017-04

2014-08-03)