自然降塵與人體兩種正常細(xì)菌的近尺寸作用分析

盧秀蘭，董發(fā)勤，鄧建軍，代群威，曾婭莉

(1綿陽(yáng)四○四醫(yī)院，四川綿陽(yáng)621000；2西南科技大學(xué))

自然降塵與人體兩種正常細(xì)菌的近尺寸作用分析

盧秀蘭1，董發(fā)勤2，鄧建軍1，代群威2，曾婭莉1

(1綿陽(yáng)四○四醫(yī)院，四川綿陽(yáng)621000；2西南科技大學(xué))

目的 分析不同地區(qū)5種自然降塵與大腸埃希菌、表皮葡萄球菌的近尺寸作用。方法 選取5種不同性質(zhì)的大氣粉塵(FC-1#、FC-2#、FC-15#、FC-18#、FC-21#)，對(duì)其特性、粒徑及粒度參數(shù)、主要化學(xué)成分進(jìn)行分析，觀察其與大腸埃希菌、表皮葡萄球菌相互作用后各培養(yǎng)液的細(xì)菌數(shù)、pH值、葡萄糖(GLU)消耗及Mn、Pb、Fe、Si等元素變化，以及細(xì)菌形態(tài)。結(jié)果 FC-1#含有較多的CaO；FC-2#、FC-15#、FC-18#、FC-21#含有較高SiO2；FC-1#、FC-15#燒失量(LOI)高于其他降塵。自然降塵顆粒直徑為0.3～1 μm。大腸埃希菌、表皮葡萄球菌與5種自然降塵相互作用后，與未作用者比較，F(xiàn)C-1#、FC-21#菌落數(shù)均增加，GLU消耗均降低，pH值均增加，P<0.05或<0.01。大腸埃希菌與FC-1#作用后Fe、Ca、Ni、Si、Al溶出增加，與FC-2#作用后僅Al溶出增加，與FC-15#作用后Fe、Ca溶出增加，與FC-18#、FC-21#作用后Ca溶出增加，P<0.05或<0.01；表皮葡萄球菌與FC-1#作用后Ca、Mg、Ni、Si、Al溶出增加，與FC-2#作用后僅Al溶出增加，與FC-15#作用后Ca、Al 溶出增加，與FC-18#作用后Ca、Mg溶出增加，與FC-21#作用后Ca溶出增加，P均<0.01。細(xì)菌形態(tài)結(jié)果表明，降塵顆粒的形狀不規(guī)則性增加了其與細(xì)菌間的膜界結(jié)合程度。結(jié)論 Ca含量高的堿性自然降塵對(duì)大腸埃希菌、表皮葡萄球菌的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用；自然降塵顆粒越小，越容易與菌體結(jié)合。

自然降塵；大腸埃希菌；表皮葡萄球菌；元素

礦物細(xì)顆粒物和微生物個(gè)體都是大氣顆粒物(PM)的重要組成部分，它們?cè)谛螒B(tài)、共存關(guān)系和空氣動(dòng)力學(xué)行為上均有高關(guān)聯(lián)度。空氣動(dòng)力學(xué)直徑<2.5 μm的礦物與菌體尺寸相近的微生物界膜的相互作用稱之為近尺寸作用[1]。當(dāng)可吸入礦物細(xì)顆粒尺寸小于亞微米級(jí)或納米級(jí)時(shí)，二者的近尺寸作用變得異常激烈，作用區(qū)域更集中在界膜兩側(cè)，這時(shí)微生物將成為作用主體和中心，納米表面效應(yīng)會(huì)在溶解、膜黏附、穿膜、膜內(nèi)作用、胞液作用和產(chǎn)物代謝等過程中表現(xiàn)出來。正常菌群不僅與人體保持平衡狀態(tài)，而且菌群之間也相互制約，以維持相對(duì)的平衡。在這種狀態(tài)下，正常菌群發(fā)揮其營(yíng)養(yǎng)、拮抗和免疫等生理作用。目前，尚不明確可吸入礦物細(xì)顆粒與大氣直接接觸的鼻腔、口腔等器官和皮膚表面的正常菌群作用后，是否會(huì)導(dǎo)致微生物毒力改變、生長(zhǎng)代謝變化，從而打破正常菌群與宿主間或正常菌群各菌種間的平衡，出現(xiàn)菌群失調(diào)[2～5]。2012年1月～2014年6月，我們采集不同地區(qū)的5種自然降塵，與人體兩種正常細(xì)菌相互作用，研究?jī)烧叩慕叽缱饔谩?/p>

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 自然降塵 選取來自生活區(qū)(戶內(nèi)和戶外)、交通地段、工業(yè)廠礦等不同性質(zhì)的5種大氣粉塵，F(xiàn)C-1#為四川省江油鐵松水泥廠輸送帶外窗臺(tái)上粉塵，F(xiàn)C-2#為綿陽(yáng)市發(fā)電廠自然沉降粉塵，F(xiàn)C-15#為西南科技大學(xué)科技處室內(nèi)粉塵，F(xiàn)C-18#為青海省西寧市南川東路汽車一廠院內(nèi)(戶外) 粉塵，F(xiàn)C-21#為甘肅省靜寧仁大鄉(xiāng)戶外窗臺(tái)粉塵。

1.1.2 細(xì)菌 大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922來自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。表皮葡萄球菌分離自四川綿陽(yáng)四○四醫(yī)院臨床菌株，由四川大學(xué)華西醫(yī)院臨床微生物中心鑒定。

1.2 方法

1.2.1 自然降塵和細(xì)菌的處理方法 電子天平準(zhǔn)確稱取上述5種礦物塵粒各100 mg，高壓蒸氣滅菌后放入10 mL普通肉湯培養(yǎng)液，制成濃度為10 mg/mL的塵粒懸液。兩種細(xì)菌分別加入普通肉湯培養(yǎng)基中增菌24 h，調(diào)整細(xì)菌濃度為1×109cfu/L。

1.2.2 分組及處理方法 實(shí)驗(yàn)組：普通肉湯培養(yǎng)液3.5 mL+自然降塵懸液0.4 mL+細(xì)菌懸液0.1 mL(使塵粒終濃度為1 mg/mL)。對(duì)照組：細(xì)菌懸液0.1 mL+普通肉湯培養(yǎng)液3.9 mL。與大腸埃希菌37 ℃共同培養(yǎng)16 h，與表皮葡萄球菌37 ℃共同培養(yǎng)24 h；每次做平行管，重復(fù)6次。

1.2.3 觀察指標(biāo)及方法 以傾倒平板法計(jì)算細(xì)菌數(shù)量；混合物以4 000 r/min離心30 min，取上清液檢測(cè)pH值、葡萄糖(GLU)消耗及Mn、Pb、Fe、Si等14種元素變化；SEM分析細(xì)菌與自然降塵作用后的形態(tài)變化。自然降塵組成分析采用PW1404型自動(dòng)X射線熒光分析儀(荷蘭Philips公司)；粒度分布測(cè)定采用Masterizer2000粒度分析儀(英國(guó)馬爾文儀器公司)；GLU消耗測(cè)定采用日本日立7600型全自動(dòng)生化儀；pH值分析采用Phox Plusl 急診生化分析儀(美國(guó)NOVA公司)；形態(tài)觀察采用S440型掃描電子顯微鏡(英國(guó)Leica公司)；微量元素測(cè)定采用Auto scan Advantge端視ICP-AES(美國(guó)TJA公司)。

2 結(jié)果

2.1 自然降塵特性 5種自然降塵主要成分分析結(jié)果見表1，顆粒直徑及粒度參數(shù)分析結(jié)果見表2。FC-1#含有較多的CaO；其他含有較高的SiO2；FC-1#、FC-15#燒失量(LOI)高于其他降塵。自然降塵顆粒直徑0.3～1 μm；直徑<0.3 μm的室內(nèi)自然降塵占6%左右，<1.0 μm的自然降塵占90%左右。

2.2 兩組菌落數(shù)、GLU消耗、pH值比較 5種自然降塵與大腸埃希菌、表皮葡萄球菌相互作用后，與各自的對(duì)照組比較，F(xiàn)C-1#、FC-21#菌落數(shù)均增加，GLU消耗均降低，pH值均增加，P<0.05或<0.01，見表3。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.3 兩組元素溶出情況 與對(duì)照組比較，大腸希菌與FC-1#作用后Fe、Ca、Ni、Si、Al溶出增加，與FC-2#作用后僅Al溶出增加，與FC-15#作用后Fe、Ca溶出增加，與FC-18#、FC-21#作用后僅Ca溶出增加，P<0.05或<0.01，見表4。5種自然降塵與表皮葡萄球菌相互作用后，與對(duì)照組比較，表皮葡萄球菌與FC-1#作用后Ca、Mg、Ni、Si、Al 溶出增加，與FC-2#作用后僅Al溶出增加，與FC-15#作用后Ca、Al 溶出增加，與FC-18#作用后Ca、Mg溶出增加，與FC-21#作用后僅Ca溶出增加，P均<0.01，見表5。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；Na及K為培養(yǎng)基主要成分，單位為×103pg/L。

注：與對(duì)照組比較，**P<0.01；Na及K為培養(yǎng)基主要成分，單位為×103pg/L。

2.4 細(xì)菌形態(tài)變化 ① 5種自然降塵與大腸埃希菌相互作用后細(xì)菌形態(tài)變化：對(duì)照組大腸埃希菌菌體表面光滑，菌體上存在一定凹陷，端部有短鞭毛，形態(tài)相對(duì)均一。實(shí)驗(yàn)組FC-1#形態(tài)為纖維狀、不規(guī)則塊狀，大小不一，部分細(xì)菌散落在較大顆粒表面，在纖維狀粉體周圍團(tuán)聚了許多細(xì)菌，且與自然降塵作用的細(xì)菌菌體凹陷增加，菌體變的“瘦長(zhǎng)”。FC-2#多呈圓球形(主要是飄塵)，幾個(gè)球形自然降塵顆粒之間有許多的大腸埃希菌菌體相互團(tuán)聚填補(bǔ)其中；有部分菌體端部鞭毛變長(zhǎng)，且其鞭毛彎曲相連，出現(xiàn)菌體破裂現(xiàn)象，留下的菌體“殘骸”仍清晰可見。FC-15#形狀不規(guī)則，大小不一，纖維狀粉體周圍團(tuán)聚了許多細(xì)菌。FC-18#及FC-21#呈不規(guī)則塊狀、片狀，在較大自然降塵顆粒表面附著有大量細(xì)小粉體，與大腸埃希菌菌體黏附，且自然降塵形成的空隙中也存在菌體，相互黏附，呈堆積生長(zhǎng)，界面接觸充分。② 5種自然降塵與表皮葡萄球菌相互作用后細(xì)菌形態(tài)變化：對(duì)照組表皮葡萄球菌菌體表面光滑，堆積成葡萄狀，形態(tài)相對(duì)均一，表面有凹陷。實(shí)驗(yàn)組FC-1#較大條塊狀自然降塵表面附著大量表皮葡萄球菌菌體，而小顆粒自然降塵(300 nm左右)又多黏附于菌體表面，層層包裹，形成團(tuán)狀。多個(gè)菌體之間也以自然降塵聚體相黏附，細(xì)菌與自然降塵相互團(tuán)聚生長(zhǎng)。甚至可以看到有部分菌體表面完全被細(xì)小自然降塵顆粒黏附包裹。小顆粒片狀自然降塵達(dá)到200 nm左右，甚至有些更為細(xì)小，呈蓬松狀；在幾種自然降塵的表面均附著有許多小顆粒自然降塵，同時(shí)也團(tuán)聚了大量的表皮葡萄球菌菌體，而自然降塵表面凹處和自然降塵顆粒之間則“填滿”了大量細(xì)菌，褶皺處有大量細(xì)菌團(tuán)聚生長(zhǎng)。大塊狀粉體周圍附著有部分菌體，但大量菌體相互團(tuán)聚，與自然降塵之間黏附程度較低。

3 討論

自然降塵在吸入人體內(nèi)部后，對(duì)人體造成的直接危害比較嚴(yán)重[6]；沒有進(jìn)入人體內(nèi)部的自然降塵會(huì)附著于體表或面部，與這些部位的正常菌群發(fā)生相互作用，對(duì)人體直接危害更為嚴(yán)重[7]。本研究所選表皮葡萄球菌與大腸埃希菌為人體體表上具有代表性的菌株，所選自然降塵的粒徑大小與兩種正常細(xì)菌的大小基本相當(dāng)，與細(xì)菌的界面接觸程度相對(duì)較高。

礦物顆粒物的空氣動(dòng)力學(xué)直徑≤2.5 μm被稱為PM2.5。自上世紀(jì)八十年代開始，一些發(fā)達(dá)歐美國(guó)家就開始重視PM2.5，并對(duì)其開展了廣泛的研究。但至目前，有關(guān)可吸入礦物細(xì)顆粒/微生物體系界膜作用過程中微生物行為的研究較少[8～10]。本研究采集的5種自然降塵95%以上為PM2.5，與大腸埃希菌及表皮葡萄球菌尺寸相近，5種自然降塵與兩種細(xì)菌作用后， Mn、Pb、Zn、K、Na、Ba、Ti 及P這8種元素均未出現(xiàn)顯著性變化，而Fe、Ca、Mg、Ni、Si、Al這6種元素則有顯著性變化。FC-1#是一種堿性粉塵，本身含有大量CaO，與兩種細(xì)菌作用后均能溶出大量Ca，表現(xiàn)出對(duì)兩種細(xì)菌的生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用；同時(shí)Ni、Si、Al、溶出也升高，表明與兩種正常菌作用后，能促進(jìn)這幾種元素的溶出。FC-21#也是一種堿性粉塵，僅含有少量的CaO，但培養(yǎng)基Ca升高，也表現(xiàn)出對(duì)兩種細(xì)菌生長(zhǎng)有明顯促進(jìn)作用。可見含Ca鈣高的堿性粉塵與細(xì)菌作用后能表現(xiàn)出較強(qiáng)的生物活性，其具體機(jī)制可能與培養(yǎng)基中微量元素的含量密切相關(guān)[11]。微量元素作為細(xì)菌代謝過程中代謝酶的激活劑或一些代謝酶的輔基在細(xì)菌生長(zhǎng)代謝過程中發(fā)揮必不可少的作用。

自然降塵在與細(xì)菌作用過程中，隨著細(xì)菌分解GLU的主要酸性代謝產(chǎn)物增加，培養(yǎng)基pH逐漸下降，中和自然降塵表面大部分的OH-，進(jìn)而促進(jìn)自然降塵的溶解，而溶解后的自然降塵會(huì)提供細(xì)菌生長(zhǎng)代謝必需的營(yíng)養(yǎng)元素，如礦物元素等，促進(jìn)細(xì)菌的增殖[12,13]。本研究中，5種自然降塵與大腸埃希菌、表皮葡萄球菌相互作用后，與各自的對(duì)照組比較，F(xiàn)C-1#、FC-21#菌落數(shù)均增加，GLU消耗增加。說明FC-1#、FC-21#這兩組粉塵能加速正常菌對(duì)GLU的分解利用，增加代謝酸性產(chǎn)物，促進(jìn)正常菌生長(zhǎng)代謝。

本研究通過SEM觀察5種自然降塵與兩種細(xì)菌相互作用后細(xì)菌形態(tài)學(xué)改變，結(jié)果也表明降塵顆粒的形狀不規(guī)則性大大增加了其與細(xì)菌間的膜界結(jié)合程度，自然降塵顆粒越小，越容易與菌體結(jié)合。已有研究表明，很多細(xì)菌表面都黏附有PM2.5的自然降塵，自然降塵越細(xì)，相互黏附度就越高，相對(duì)表面積越大，界膜接觸面就越充分，與細(xì)菌接觸的機(jī)會(huì)就越多，接觸程度越高。近尺寸作用就會(huì)越激烈。同時(shí)細(xì)菌喜歡寄居于粉塵顆粒不規(guī)則表面，降塵顆粒的形狀不規(guī)則性大大增加了其與細(xì)菌間的膜界結(jié)合程度，如自然降塵表面凹處和自然降塵顆粒之間會(huì)填滿大量細(xì)菌，表現(xiàn)各菌體團(tuán)聚與黏附。

現(xiàn)階段人們?cè)絹碓街匾暛h(huán)境超細(xì)顆粒物的健康效應(yīng)，但大多注重其對(duì)呼吸系統(tǒng)的作用。本研究結(jié)果表明，Ca含量高的堿性自然降塵對(duì)大腸埃希菌、表皮葡萄球菌的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用；自然降塵顆粒越小，越容易與菌體結(jié)合。但自然降塵與兩種細(xì)菌作用過程中，如對(duì)礦物顆粒物的圓化、粉化、槽蝕等行為，以及由此引起的顆粒物表面形態(tài)、基團(tuán)、活性、電荷等發(fā)生什么樣的礦物學(xué)變化等問題[14～16]，還有待于進(jìn)一步研究。

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Near size reciprocity between natural dustfalls and two normal bacteria of human body in vitro

LUXiu-lan1,DONGFa-qin,DENGJian-jun,DAIQun-wei,ZENGYa-li

(1SichuanMianyang404Hospital,Mianyang621000,China)

Objective To analyze the near size reciprocity of five kinds of natural dustfalls from different areas on human escherichia coli and staphylococcus epidermidis. Methods We chose five kinds of different natural dustfalls (FC-1#, FC-2#, FC-15#, FC-18#and FC-21#) to analyze their features, grain diameter, grain size parameter and major chemical constituents. In separate culture medium where each dustfall interacted with escherichia coli and staphylococcus epidermidis, we observed the changes of elements such as bacterial counts, pH value, GLU, Mn, Pb, Fe, Si and the transition of bacterial morphology. Results FC-1#contained more CaO; FC-2#, FC-15#, FC-18#, FC-21#contained more SiO2; and the LOI of FC-1#and FC-15#was higher than other dustfalls. The natural dust particle diameter was 0.3-1 μm. After five different natural dustfalls interacted with escherichia coli and staphylococcus, we compared it with that of each control group, bacterial colonies of FC-1#, FC-21#increased, GLU consume reduced and pH value increased (P<0.05 orP<0.01). After interacting with escherichia coli, we compared it with that of the control group, the dissolution of Fe, Ca, Ni, Si and Al in FC-1#increased, only the dissolution of Al increased in FC-2#, the dissolution of Fe and Ca increased in FC-15#, and the dissolution of Ca increased in FC-18#and FC-21#(P<0.05 orP<0.01). After interacting with staphylococcus epidermidis, we compared it with that of the control group, the dissolution of Ca, Mg, Ni, Si and Al increased in FC-1#, only the dissolution of Al increased in FC-2#, the dissolution of Fe, Ca increased in FC-15#, the dissolution of Ca, Mg increased in FC-18#, and the dissolution of Ca increased in FC-21#(allP<0.01). The result of bacterial morphology indicated that the irregular shape of dustfalls enhanced cohesion with bacterial membranes. Conclusions Alkaline natural dustfalls with high level of Ca can promote the growth of escherichia coli and staphylococcus epidermidis. The smaller the particle of natural dust falls is, the easier dustfalls cohere with bacteria.

natural dustfalls; escherichia coli; staphylococcus epidermidis; element

國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(41130746)；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(41472046)。

盧秀蘭(1973-)，女，主管技師，主要從事職業(yè)病及毒理學(xué)研究。E-mail: srt_latour@qq.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2015.12.002

R122.26

A

1002-266X(2015)12-0005-05

2014-11-19)