擴張型心肌病患者外周血單個核細胞miR-155表達及意義

顏小飛，黃糧，嚴蓮花，胡芬，王亞，馬聞晗，盧帥，，汪朝暉( 華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院，武漢4300;武漢市第四醫院)

擴張型心肌病患者外周血單個核細胞miR-155表達及意義

顏小飛1，黃糧2，嚴蓮花1，胡芬1，王亞1，馬聞晗1，盧帥1，2，汪朝暉1
( 1華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院，武漢430022;2武漢市第四醫院)

摘要:目的探討微小RNA-155( miR-155)在擴張型心肌病( DCM)患者外周血單個核細胞( PBMC)中的表達變化及其與心功能的關系。方法選擇DCM患者(觀察組)及同期健康志愿者(對照組)各30例，觀察組NYHA心功能Ⅱ級10例、Ⅲ級11例、Ⅳ級9例。采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離兩組空腹靜脈血中的PBMC，實時熒光定量PCR法檢測PBMC中miR-155的相對表達量。比較觀察組不同NYHA心功能分級者PBMC中miR-155的相對表達量，并分析其相關性。觀察組同時行彩色多普勒檢查，記錄其左心室射血分數( LVEF)、左心室舒張末期內徑( LVEDd)，分析兩者與miR-155表達的相關性。結果觀察組miR-155相對表達量為0.50±0.24，對照組為1.00±0.23;兩組比較，P＜0.01。觀察組NYHA心功能Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級者miR-155相對表達量分別為0.77±0.10、0.47±0.10、0.23±0.08，多組間及組內兩兩比較，P均＜0.01。觀察組LVEF為28%±10%，LVEDd為( 70±7) mm。觀察組miR-155相對表達量與NYHA心功能分級、LVEF、LVEDd均呈負相關( r分別為－0.94、－0.67、－0.53，P＜0.05或＜0.01)。結論DCM患者PBMC中miR-155表達降低，與患者心功能受損的嚴重程度有關。

關鍵詞:擴張型心肌病;微小RNA-155;外周血單個核細胞;心功能

Expression changes and significance of miR-155 in peripheral blood mononuclear cells of patients with dilated cardiomyopathy

YAN Xiao-fei1，HUANG Liang，YAN Lian-hua，HU Fen，WANG Ya，MA Wen-han，LU Shuai，WHANG Zhao-hui
( 1 Union Hospital，Tongji Medicial College of Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430022，China)

Abstract:Objective To observe the expression changes of microRNA-155 ( miR-155) in the peripheral blood mononuclear cells ( PBMC) of patients with dilated cardiomyopathy ( DCM) and to explore the relationship between miR-155 level and heart function.Methods Thirty patients with DCM ( observation group) and 30 healthy volunteers ( control group) were selected.In the observation group，10 cases were gradeⅡof NYHA functional classification，11 cases were gradeⅢand 9 cases were gradeⅣ.PBMC in the two groups were separated by Ficoll-Hypaque density gradient centrifugation，and the relative expression of miR-155 was detected by real-time fluorescence quantitative PCR.The miR-155 levels were compared between the observation group and the control group and among DCM patients with different NYHA functional classification.In the observation group，the left ventricular ejection fraction ( LVEF) and left ventricular end diastolic diameter ( LVEDd) were recorded by color Doppler ultrasound.The relationships between miR-155 levels and LVEF，LVEDd were analyzed in DCM patients.Results The relative expression levels of miR-155 in the observation group and control group were ( 0.50±0.24) and ( 1.00±0.23)，which showed a significant difference ( P＜0.01).The relative expression levels of miR-155 in NYHA functional classificationⅡ，Ⅲ，ⅣDCM patients were ( 0.77±0.10)，( 0.47± 0.10) and ( 0.23±0.08)，respectively.There were significant differences between each two groups ( all P＜0.01).In the observation group，the LVEF was 28%±10%，and the LVEDd was ( 70±7) mm.The miR-155 level was negatively

correlated with NYHA functional classification，LVEF and LVEDd in DCM patients ( r =－0.94，－0.67 and－0.53，P ＜0.05 or P＜0.01).Conclusions The expression level of miR-155 is down-regulated in PBMC of DCM patients and is correlated with the severity of impaired cardiac function.

Key words:dilated cardiomyopathy; microRNA-155; peripheral blood mononuclear cells; cardiac function

擴張型心肌病( DCM)是以左心室或雙心室擴大和收縮功能受損為特征、細胞免疫和體液免疫共同參與的自身免疫性疾病［1］，其發病機制尚未完全闡明。微小RNA( microRNAs)是一類長19～25個核苷酸、不具備蛋白質編碼功能的單鏈小分子RNA，它們通過與靶mRNA完全或不完全互補配對，降解靶mRNA或者抑制靶mRNA翻譯成蛋白質，從而調節基因表達［2］。microRNA-155 ( miR-155)在造血細胞的分化、炎癥反應、免疫應答、腫瘤的發生等多種生物學過程中均發揮重要作用［3］，但其與DCM發生、發展相關性的報道較少。本研究觀察了miR-155在DCM患者外周血單個核細胞( PBMC)中的表達情況，并探討其與心功能的關系。

1　資料與方法

1.1臨床資料選擇2013年12月～2014年12月在華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院心血管內科住院的DCM患者30例(觀察組)，其中男21例、女9例，年齡26～55( 41±12)歲; NYHA心功能Ⅱ級10例、Ⅲ級11例、Ⅳ級9例。均符合1995年WHO/ISFC制定的DCM診斷標準［4］，排除高血壓、冠心病、心臟瓣膜病、肺心病、代謝性疾病患者。選取同期健康志愿者30例(對照組)，其中男20例、女10例，年齡23～58( 39±11)歲。兩組性別、年齡均具有可比性。本研究獲得華中科技大學同濟醫學院倫理委員會批準，研究對象均簽署知情同意書。

1.2 PBMC分離及miR-155表達檢測采集兩組空腹靜脈血5 mL于EDTA-K2抗凝管中，1 h內采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離PBMC。TRIzol試劑從PBMC中提取總RNA，具體操作參見試劑盒說明書。紫外分光光度計測定RNA樣品在波長260 nm和280 nm處的吸光度( A)值，A260/A280在1.8～2.0表示RNA純度較好。逆轉錄合成cDNA，采用實時熒光定量PCR法檢測miR-155相對表達量。miR-155、U6的逆轉錄和PCR引物均由廣州銳博公司設計、合成。miR-155上游引物: 5'- GGAGGTTAATGCTAATCGTGATAG-3'，下游引物: 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'，擴增長度60 bp;以U6為內參，上游引物: 5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，下游引物: 5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'，擴增長度94 bp。PCR反應體系50 μL: 2 ×PCR Master Mix 25 μL，5 μmol/L的上、下游引物各0.5 μL，cDNA 5 μL，去離子水加至50 μL。PCR反應條件: 95℃10 s，95℃15 s，60℃60 s，循環40次。通過Ct值和標準曲線對起始模板進行定量分析，miR-155相對表達量用2－ΔΔCt表示。實驗用淋巴細胞分離液購于美國GE公司，TRIzol試劑購于美國Invitrogen公司，紫外分光光度計購于日本Shi madzu公司，Reverse Transcription System購于美國Promega公司，SYBR Green PCR Master Mix Kit、實時定量PCR儀購于美國Applied Biosystems公司。

1.3心功能檢查觀察組行彩色多普勒檢查(彩色多普勒超聲診斷儀，荷蘭Philips公司)，記錄左心室射血分數( LVEF)和左心室舒張末期內徑( LVEDd)。

1.4統計學方法采用SPSS13.0統計軟件。計量資料以珋x±s表示，多組間比較采用秩和檢驗，兩組間比較采用單因素方差分析。觀察組PBMC中miR-155相對表達量與NYHA心功能分級及LVEF LVEDd的關系采用Spearman或Pearson相關分析P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1兩組miR-155相對表達量比較觀察組miR 155相對表達量為0.50±0.24，對照組為1.00± 0.23;兩組比較，P＜0.01。

2.2觀察組不同NYHA心功能分級者miR-155相對表達量比較觀察組NYHA心功能Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級者miR-155的相對表達量分別為0.77±0.10、0.47 ±0.10、0.23±0.08，多組間及組內兩兩比較，P均＜0.01。

2.3觀察組miR-155相對表達量與心功能分級LVEF及LVEDd的關系觀察組LVEF為28%± 10%，LVEDd為( 70±7) mm。Spearman相關分析顯示，觀察組miR-155相對表達量與NYHA心功能分級呈負相關( r =－0.94，P＜0.01) ; Pearson相關分析顯示，觀察組miR-155相對表達量與LVEF LVEDd均呈負相關( r分別為－0.67、－0.53，P均＜0.05)。

3　討論

DCM是年輕人終末期心力衰竭和心臟移植的主要原因［5］，其發病機制至今尚未完全明確。研究

顯示，部分病毒性心肌炎( VMC)可以演變為DCM［6，7］，故有學者認為VMC和DCM可能是同一疾病的兩個不同階段［8］。研究發現，DCM患者血清中存在多種抗心肌自身抗體［9］，以及輔助性T細胞( Th)和調節性T細胞失衡［1，10］，表明細胞免疫和體液免疫可能均參與了DCM的發病過程。

miR-155是一個典型的多功能microRNA，對巨噬細胞、樹突狀細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞等多種炎癥免疫細胞均具有調節作用，可影響天然免疫和獲得性免疫過程，與多種免疫炎癥性疾病的發生發展有關［11，12］。Satoh等［13］研究顯示，DCM患者心肌組織miR-155表達明顯低于左心室功能正常人群，提示miR-155可能負向調控DCM的發生、發展。本研究結果顯示，觀察組PBMC中miR-155表達降低，說明miR-155可能是DCM發生的一種保護性因子;而觀察組NYHA心功能Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級者miR-155表達依次降低，且miR-155表達與NYHA心功能分級、LVEF、LVEDd均呈顯著負相關，以上均說明miR-155表達與DCM患者心功能受損的嚴重程度有關，可作為判斷病情的指標之一。

O'Connell等［14］、Murugaiyan等［15］研究證實，自身免疫性腦脊髓炎( EAE)小鼠PBMC中miR-155表達上調、Th1/Th17比例升高，而miR-155敲除的EAE小鼠Th1/Th17比例明顯降低。Yao等［16］研究發現，miR-155在急性冠脈綜合征患者PBMC中表達明顯降低，而Th17細胞比例卻是升高的。以上說明在不同的病理狀態下，miR-155對Th17有不同的調節作用。本研究樣本量偏少，沒有檢測T、B淋巴細胞等免疫相關指標，因此對miR-155在DCM發病中的機制尚未明了，需要進一步的研究證實。

參考文獻:

［1］Li J，Wang L，Wang S，et al.The treg/th17 imbalance in patients with idiopathic dilated cardiomyopathy［J］.Scandinavian J Immunol，2010，71( 4) : 298-303.

［2］Saki N，Abroun S，Soleimani M，et al.Involvement of microrna in t-cell differentiation and malignancy［J］.Int J Hematol Oncol Stem Cell Res，2015，9( 1) : 33-49.

［3］Elton TS，Selemon H，Elton SM，et al.Regulation of the miR-155 host gene in physiological and pathological processes［J］.Gene， 2013，532( 1) : 1-12.

［4］Richardson P，McKenna W，Bristow M，et al.Report of the 1995 world health organization/international society and federation o cardiology task force on the definition and classification of cardio myopathies［J］.Circulation，1996，93( 5) : 841-842.

［5］Caforio AL，Tona F，Bottaro S，et al.Clinical implications of anti heart autoantibodies in myocarditis and dilated cardiomyopathy ［J］.Autoimmunity，2008，41( 1) : 35-45.

［6］D'Ambrosio A，Patti G，Manzoli A，et al.The fate of acute myo carditis between spontaneous improvement and evolution to dilated cardiomyopathy: A review［J］.Heart，2001，85( 5) : 499-504.

［7］Caforio AL，Pankuweit S，Arbustini E，et al.Current state o knowledge on aetiology，diagnosis，management，and therapy o myocarditis: A position statement of the european society of cardiol ogy working group on myocardial and pericardial diseases［J］.Eu Heart J，2013，34( 33) : 2636-2648.

［8］Caforio AL，Marcolongo R，Jahns R，et al.Immune-mediated and autoimmune myocarditis: Clinical presentation，diagnosis and man agement［J］.Heart Fail Rev，2013，18( 6) : 715-732.

［9］Nussinovitch U，Shoenfeld Y.The clinical and diagnostic signifi cance of anti-myosin autoantibodies in cardiac disease［J］.Clin Rev Allergy Immunol，2013，44( 1) : 98-108.

［10］Yuan J，Cao AL，Yu M，et al.Th17 cells facilitate the humora immune response in patients with acute viral myocarditis［J］.Clin Immunol，2010，30( 2) : 226-234.

［11］Mashima R.Physiological roles of miR-155［J］.Immunology 2015，145( 3) : 323-333.

［12］Leng RX，Pan HF，Qin WZ，et al.Role of microrna-155 in autoim munity［J］.Cytokine Growth Factor Rev，2011，22( 3) :141-147.

［13］Satoh M，Minami Y，Takahashi Y，et al.A cellular microrna，let 7i，is a novel biomarker for clinical outcome in patients with dilated cardiomyopathy［J］.J Card Fail，2011，17( 11) : 923-929.

［14］O'Connell RM，Kahn D，Gibson WS，et al.Microrna-155 pro motes autoimmune inflammation by enhancing inflammatory T cel development［J］.Immunity，2010，33( 4) : 607-619.

［15］Murugaiyan G，Beynon V，Mittal A，et al.Silencing microrna-155 ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis［J］.J Im munol，2011，187( 5) : 2213-2221.

［16］Yao R，Ma Y，Du Y，et al.The altered expression of inflamma tion-related micrornas with microrna-155 expression correlates with th17 differentiation in patients with acute coronary syndrome［J］.Cell Mol Immunol，2011，8( 6) : 486-495.

·基礎研究·

收稿日期:( 2015-06-11)

通信作者簡介:汪朝暉( 1969-)，女，主任醫師，研究方向為心血管病;曾獲教育部科技進步二等獎1項和湖北省科技進步一等獎和二等獎各1項。E-mail: sgwangtjm@163.com

作者簡介:第一顏小飛( 1979-)，男，主治醫師，研究方向為心血管病。E-mail: yxfb329@163.com

基金項目:國家自然科學基金資助項目( 81170205)。

文章編號:1002-266X( 2015) 32-0020-03

文獻標志碼:A

中圖分類號:R542.21

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.32.007