食管鱗狀細(xì)胞癌組織P16基因啟動子區(qū)CpG單位甲基化狀態(tài)檢測及意義

劉芳，康雪，劉曉燕，張寧，齊翠花，黎永軍，鄭勇，陳衛(wèi)剛(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆石河子832000)

食管鱗狀細(xì)胞癌組織P16基因啟動子區(qū)CpG單位甲基化狀態(tài)檢測及意義

劉芳，康雪，劉曉燕，張寧，齊翠花，黎永軍，鄭勇，陳衛(wèi)剛
(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆石河子832000)

摘要:目的探討食管鱗狀細(xì)胞癌組織P16基因啟動子區(qū)CpG單位的甲基化與其發(fā)病的關(guān)系。方法收集食管鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本35份(觀察組)和正常食管組織46份(對照組)，采用MassARRAY甲基化DNA定量分析技術(shù)檢測兩組P16基因啟動子區(qū)19個CpG單位的甲基化狀態(tài)，秩和檢驗(yàn)比較兩組CpG單位的甲基化率。結(jié)果觀察組P16基因啟動子區(qū)CpG單位總甲基化率為9.06%±7.11%，對照組為8.48%±6.34%;兩組比較，P＞0.05。觀察組P16基因啟動子區(qū)CpG11-12位點(diǎn)甲基化率為11.34%±8.47%，對照組為7.25%±5.60%;兩組比較，P＜0.05;兩組其余18個CpG單位甲基化率比較，P均＞0.05。結(jié)論P(yáng)16基因啟動子區(qū)CpG11-12位點(diǎn)的甲基化可能與食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病有關(guān)。

關(guān)鍵詞:食管鱗狀細(xì)胞癌; P16基因; CpG單位;甲基化

Detection and significance of CpG unit methylation in P16 gene promoter region of esophageal squamous cell carcinoma

LIU Fang，KANG Xue，LIU Xiao-yan，ZHANG Ning，QI Cui-hua，LI Yong-jun，ZHENG Yong，CHEN Wei-gang
( The First Affiliated Hospital of Medical College of Shihezi University，Shihezi 832000，China)

Abstract:Objective To detect the CpG unit methylation in the P16 gene promoter region of esophageal squamous cell carcinoma tissues and the significance.Methods We collected 35 cases of esophageal squamous cell carcinoma samples ( observation group) and 46 cases of normal esophageal tissues ( control group).We used MassARRAY methylation DNA quantitative analysis technology to detect the methylation status of 19 CpG units of P16 gene promoter region，and we used Rank test to compare the CpG methylation rates of the two groups.Results The 19 CpG unit methylation rates in the P16 gene promoter region of the observation group and control group were 9.06%±7.11% and 8.48%±6.34%，respectively.No significant difference was found between the two groups，P＞0.05.The methylation rate of P16 gene in ESCC of CpG unit 11-12 was 11.34%±8.47% in the observation group，and 7.25%±5.60% in the control group ( P＜0.05) ; and no significance was found in the methylation rate of other 18 units between the two groups ( all P＞0.05).Conclusion The methylation of CpG11-12 site in the P16 gene promoter region may be associated with the esophageal squamous cell carcinoma.

Key words:esophageal squamous cell carcinoma; P16 gene; CpG unit; methylation

我國食管癌具有十分明顯的地區(qū)性分布特點(diǎn)，其中新疆伊犁哈薩克自治州是高發(fā)區(qū)之一［1，2］。P16基因是1993年由Serrano和Beach等發(fā)現(xiàn)的位于人類9號染色體的抑癌基因［3］，其甲基化可發(fā)生于肺癌、乳腺癌、口腔鱗癌等多種腫瘤中［4～6］，但目前關(guān)于食管鱗狀細(xì)胞癌P16基因甲基化的研究較少。CpG雙核苷酸在人類基因組中的分布很不均一，在基因組某些區(qū)段中的表達(dá)高于正常概率，這些區(qū)段被稱作CpG島，其主要位于基因的啟動子和第一外顯子區(qū)域。以往的研究證實(shí)，基因啟動子區(qū)高甲基化導(dǎo)致抑癌基因失活是人類腫瘤的共同特征之一。因此，我們采用MassARRAY甲基化DNA定量

分析技術(shù)檢測食管鱗狀細(xì)胞癌組織P16基因啟動子區(qū)19個CpG單位的甲基化情況，現(xiàn)分析結(jié)果并探討其意義。

1　材料與方法

1.1材料35份食管鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本(觀察組)、46份正常食管組織標(biāo)本(對照組)均由2011年1月～2012年12月新疆哈薩克族自治州新源縣人民醫(yī)院收集并均經(jīng)病理檢查確定診斷。觀察組患者男17例、女18例，年齡40～70歲、中位年齡55歲;均未經(jīng)過放化療及藥物治療;分化程度為高分化12例，中分化13例，低分化10例。對照組患者男22例、女24例，年齡40～70歲、中位年齡55歲。兩組性別、年齡均具有可比性。QIAamp DNA Mini Kit試劑盒購于德國QIAGEN公司，蛋白酶K購于Merck公司，焦碳酸二乙酸購于德國Sigma公司。DM-86L26型超低溫保存箱購于中國Haier公司，TP650 型PCR循環(huán)儀購于日本TaKaRa公司，042BR11269型水平式電泳儀、GEL-DOC2000型凝膠圖象成像儀均購于美國BIO-RAD公司，ZF型紫外分析儀購于上海康華生化儀器制造廠。

1.2食管組織P16基因啟動子區(qū)CpG單位甲基化檢測采用MassARRAY甲基化DNA定量分析技術(shù)。按照QIAamp DNA Mini Kit試劑盒說明書分別提取兩組總DNA 50 μL，應(yīng)用β-actin對提取的DNA質(zhì)量進(jìn)行檢測。紫外分光光度計(jì)檢測DNA濃度，合格樣品標(biāo)準(zhǔn):①濃度＞75 ng/μL;②總量≥1 μg;③電泳主帶明顯且沒有降解;④A260/A280為1.7～2.1。將檢驗(yàn)合格的DNA置于－20℃冰箱保存，對DNA樣品進(jìn)行亞硫酸鹽處理，嚴(yán)格按照EZ DNA Methylation-Gold Kit試劑盒說明書操作。對樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，P16基因啟動子區(qū)上游引物: 3'-AGGAAGAGAGGTTAGGAGGAGGTTTGTGATTAT-5'，下游引物: 3'-CAGTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCTTCCCCTTACCTAAAAAAATACC-5'，擴(kuò)增長度442 bp，所有引物由上海生物有限公司設(shè)計(jì)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過堿性磷酸酶處理及純化，使用點(diǎn)樣儀將純化后的產(chǎn)物點(diǎn)至384孔SpectroCHIP芯片上，將點(diǎn)制好的芯片放入MassARRAY Compact System，采用MALDI-TOF技術(shù)進(jìn)行檢測。EpiTYPER軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并輸出19個CpG單位的甲基化率。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以珋x±s表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本的Mann-Whitney U檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1兩組P16基因啟動子區(qū)CpG單位總甲基化率比較觀察組P16基因啟動子區(qū)CpG單位總甲基化率為9.06%±7.11%，對照組為8.48%±6.34%;兩組比較，P＞0.05。

2.2兩組P16基因啟動子區(qū)19個CpG單位的甲基化率比較觀察組和對照組CpG_1甲基化率分別為8.24%±5.21%、9.12%±6.08%，CpG_3甲基化率分別為9.82%±15.14%、7.20%±12.51%，CpG_4甲基化率分別為29.05%±21.55%、25.65%±20.85% CpG_5-6甲基化率分別為9.60%±8.00%、8.75%± 5.62%，CpG_7甲基化率分別為8.24%±5.21% 9.12%±6.08%，CpG_8-9甲基化率分別為9.60%± 8.00%、8.75%±5.62%，CpG_10甲基化率分別為6.16%±9.50%、8.38%±13.46%，CpG_13-14甲基化率分別為8.67%±7.48%、5.78%±4.53%，CpG_ 15-16甲基化率分別為3.00%±4.57%、3.73%± 6.39%，CpG_17甲基化率分別為6.16%±9.50% 8.38%±13.46%，CpG _18-21甲基化率分別為14.19%±9.23%、14.34%±7.45%，CpG_22甲基化率分別為2.60%±4.42%、2.56%±5.25%，CpG_ 23-25甲基化率分別為23.73%±10.15%、22.55% ±8.19%，CpG_30-31甲基化率分別為1.80%± 3.16%、2.20%±2.96%，CpG_32甲基化率分別為2.60%±4.42%、2.56%±5.25%，CpG_33-35甲基化率分別為9.58%±7.12%、7.00%±4.22%，CpG _38甲基化率分別為5.42%±6.15%、5.34%± 5.89%，CpG _39-40甲基化率分別為1.80%± 3.16%、2.20%±2.96%;兩組比較，P均＞0.05觀察組和對照組CpG _11-12甲基化率分別為11.34%±8.47%、7.25%±5.60%，兩組比較，P＜0.05。

3　討論

食管鱗狀細(xì)胞癌是我國常見的惡性腫瘤，其致病原因目前尚未明確，研究顯示其發(fā)病可能與飲用熱水、食用含亞硝酸鹽食物及遺傳因素等有關(guān)。有研究證實(shí)，遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)的改變是食管癌發(fā)病的主要機(jī)制，而抑癌基因啟動子區(qū)高甲基化是表觀遺傳修飾的主要方式［7，8］。P16蛋白可抑制細(xì)胞的生長、增殖，失活后最終可引起腫瘤發(fā)生［9］。余煒偉等［10］發(fā)現(xiàn)，P16基因高甲基化后會降低蛋白的表達(dá)。劉清等［11］研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的形成受抑癌基因啟動子區(qū)甲基化的影響。以上均說明P16基因啟動子區(qū)高甲基化可能與腫瘤的發(fā)生有關(guān)。趙燕等［12］研究發(fā)現(xiàn)，P16基因啟動子區(qū)高甲基化是新疆哈薩克族、漢族食管癌發(fā)病的高危因素。而本研究中兩組P16基因啟動子區(qū)CpG單位總甲基化率比較無

統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與以往研究結(jié)論不一致，考慮與樣本量過少或研究方法不同有關(guān)，本研究結(jié)論仍需擴(kuò)大樣本進(jìn)一步證實(shí)。

本研究共檢測了P16基因啟動子區(qū)的19個CpG單位，發(fā)現(xiàn)觀察組P16基因啟動子區(qū)CpG_11-12位點(diǎn)甲基化率顯著高于對照組，說明P16基因啟動子區(qū)CpG_11-12位點(diǎn)甲基化可能與食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病有關(guān)。CpG_11-12位點(diǎn)甲基化后引起P16基因缺失，蛋白表達(dá)水平隨之降低，其抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用減弱，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞大量增殖，最終引起食管癌的發(fā)生［13］。

研究表明，基因異常甲基化這一過程可以逆轉(zhuǎn)，對癌前病變患者或腫瘤患者進(jìn)行去甲基化處理可達(dá)到恢復(fù)抑癌基因功能的目的。楊婷等［14］對食管癌細(xì)胞株應(yīng)用基因甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑( DNMT) 5-雜氮-2'脫氧胞苷進(jìn)行處理，使甲基化的抑癌基因重新表達(dá)，從而抑制食管癌細(xì)胞株生長。也有研究將野生型P16基因?qū)肽[瘤細(xì)胞，代替失活的P16基因，從而發(fā)揮其抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用［15］。但是DNMT抑制劑特異性低，可能會引起處于抑制狀態(tài)的癌基因激活，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。目前，DNMT抑制劑僅在理論上可能具有去甲基化作用，并沒有應(yīng)用于臨床，下一步我們研究的重點(diǎn)為去甲基化劑的作用機(jī)制及應(yīng)用效果。

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收稿日期:( 2014-01-10)

通信作者簡介:陳衛(wèi)剛( 1968-)，男，主任醫(yī)師，主要從事消化道腫瘤的診療工作。E-mail: cwgsh@126.com

作者簡介:第一劉芳( 1980-)，女，主治醫(yī)師，主要從事消化道腫瘤的診療工作。E-mail: 1051584797@ qq.com

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目( 81260362) ;石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)與臨床醫(yī)學(xué)聯(lián)合科研基金資助項(xiàng)目( LHJJ2010B04)。

文章編號:1002-266X( 2015) 32-0005-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號:R735.1

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.32.002