熒光碳點及其在生物醫學領域的應用進展

趙菁，叢明宇，趙亮，王丹丹，常蓓，孫宏晨(吉林大學口腔醫學院，長春130021)

熒光碳點及其在生物醫學領域的應用進展

趙菁，叢明宇，趙亮，王丹丹，常蓓，孫宏晨
(吉林大學口腔醫學院，長春130021)

摘要:熒光碳點是納米材料領域的新興材料，作為新興量子點具有生物相容性好、粒徑小、熒光穩定無閃爍不漂白、易于修飾等獨特的理化特征，這些優勢使其在生物醫學領域具有廣泛的應用前景。目前關于熒光碳點的應用主要集中在生物成像，熒光標記、生物傳感器、藥物及基因載體等方面。本文綜述了熒光碳點在生物醫學領域的應用基礎，包括其生物相容性、熒光性能、攝取機制，分析了碳點在上述各醫學領域的應用現狀，并討論了未來的研究內容和方向以及亟待研究的重要問題。

關鍵詞:熒光碳點;生物醫學;生物成像;生物傳感器;納米載體

2004年，美國化學家Walter Scrivens在一次關于單壁碳納米管的實驗中偶然得到了一種熒光納米材料，并命名為熒光碳點［1］。合成熒光碳點的原料非常廣泛，成本低廉，制備方式多樣。近年來，許多學者對熒光碳點的合成方法、生物學應用展開了大量研究，并取得了較大進展。熒光碳點的粒徑為2～10 nm，具有多色熒光性能，由于其還具有上述易于制備、成本低廉等特征，并且水溶性好、表面官能團豐富、易于修飾、生物相容性優，因此在生物醫學領域的發展前景十分廣闊?，F階段關于熒光碳點的研究主要集中在生物成像、生物傳感器、基因/藥物載體等方面。本研究對熒光碳點在生物醫學領域的應用現狀以及展望作一綜述。

1　熒光碳點的生物學性質

1.1生物相容性從目前的研究成果來看，熒光碳點具有非常好的生物相容性。傳統的量子點含有金屬元素，對生物體的毒性較大，所以一般用于實驗研究而不能作為臨床上體內示蹤的試劑。而熒光碳點則毒性很低，在體內外的實驗研究均有報道。有研究將熒光碳點和傳統量子點作用于MCF-7細胞和HT-29細胞，并通過增殖、凋亡率及存活率三方面對其毒性進行了評價，結果證明與量子點相比，熒光碳點具有絕對的優勢［2］。將碳點與細胞共孵育后，從形態學上看，未發現對細胞產生改變［3］;在體內實驗方面，通過小鼠存活率、表現癥狀、體質量變化、血生化檢測、病理學分析等多方面的評估，均未發現熒光碳點的任何毒性作用。為了監測熒光碳點引起的免疫炎癥反應，Unfried等［4］就碳點對免疫功能的影響作了研究，發現碳點能夠通過增加BALB/c鼠的CD+3和INF-γ分泌，減少CD+4/CD+8所占比例而減少Th1和Tc的反應;但這并不足以使其免疫器官發生形態學上的改變。雖然免疫學的評估需要進一步完善，但是實驗發現，在動物活體標記實驗中，由于熒光碳點粒徑小，可以及時地通過動物腎臟排出體外。

1.2熒光性能近年來，雙光子成像材料，如量子點CdSe在體內外成像研究中逐漸被應用，該技術雖然在分辨率上有一定優勢，且熒光穩定無閃爍不漂白，但生物相容性較差。而熒光碳點不但具備這樣的性能而且具有更好的生物相容性［5］，因此隨著雙光子成像技術日漸廣泛地應用于成像研究，基于熒光碳點的雙光子或多光子成像材料將更適于醫學領域的應用與研究［6］。實際上，目前熒光碳點的高效熒光性能在生物熒光標記方面已得到一定的研究和應用，并且將利于其進行示蹤及對各種相關信號通路的研究。研究發現，發射量子產率隨著熒光碳點的尺寸而有所改變，尺寸減小，熒光效率得以提高，說明熒光性能對粒徑有一定的依賴性，這一發現將有利于具有更佳性能的熒光碳點的研發［7］。另外，溶劑、pH等因素對熒光碳點的熒光性能也有重要影響［8］，提示在對熒光碳點的設計中應充分、全面考慮上述因素。

1.3細胞對熒光碳點的攝取細胞對納米材料的攝取方式主要取決于如下三點:①材料的物理化學

性能，如化學組成、尺寸、形狀等;②細胞因素，如細胞類型和分化狀態;③體外實驗微環境或細胞微環境等。值得注意的是，ROS的產生與細胞對一些納米顆粒的攝取有關，這解釋了納米顆粒細胞毒性的成因［4］。熒光碳點與細胞共孵育后，可見其主要聚集于細胞膜上及細胞質內，僅有少量進入細胞核［9］。傳統的納米親水分子是以內吞作用進入細胞膜，但是一些分子，如富勒烯、傳統量子點等由于其粒徑小可以通過滲透作用穿過細胞膜。Ruan等［10］的實驗研究表明，熒光碳點進入細胞的方式并非通過內吞作用形成核內體，在線粒體也未見明顯定位，這將更利于細胞對碳點的耐受，從而也表現出良好的生物相容性。

關于細胞對熒光碳點的攝取有很多影響因素，熒光碳點的濃度是很重要的一個方面。很多實驗表明，隨著熒光碳點濃度的增加，細胞的攝取量也隨之增加;熒光碳點即使高達500 μg/mL也不會達到飽和狀態［10］。另外，熒光碳點被細胞攝取也受溫度的影響。Delehanty等［11］將熒光碳點水溶液作用于人乳腺癌MCF-7細胞，結果顯示，在37℃下，該細胞能夠被激發出明亮的熒光，然而在4℃下，并不能觀察到有意義的攝取行為。關于這一現象的具體原因尚未明確，有待進一步探索。對于細胞對納米材料攝取的研究很廣泛，影響量子點進入細胞的方式主要有三種:①鈍化材料(例如使用PEI、PPEI-EI等)，這主要與量子點的內在理化性能相關。②用肽、蛋白質等功能性分子或多聚物、藥物進行表面修飾，以利于內吞作用或增強與細胞間相互作用。③通過顯微注射或電穿孔法直接運送至細胞內。上述方法對干預熒光碳點這種新型量子點的攝取具有一定的指導意義。

2　熒光碳點在的生物醫學中的應用

2.1生物成像熒光碳點在生物醫學影像學和腫瘤診斷方面具有突出的優勢和良好的發展前景。如前所述，熒光碳點表面具有很多官能團，利于進行表面修飾。若將熒光碳點與生物活性分子偶聯并特異性靶向某些細胞，在腫瘤的診斷治療、血管成像等方面將有一定的發展前景。現普遍認為人類許多腫瘤細胞都表現出葉酸受體的明顯上調，而在正常細胞中葉酸受體只有少量分布［12］。Song等［3］將4，7，10-三氧-1，13-十三烷二胺鈍化的熒光碳點與葉酸結合，利用熒光碳點的熒光特點可以將具有葉酸受體的腫瘤細胞與正常細胞區分開來。Liu等［13］將葡萄糖與聚丙烯酸鈉合成了一種熒光碳點，并與葉酸溶液混合，作用于共培養的Hela和HEK-293細胞，通過共聚焦成像證實了該熒光碳點的靶向及示蹤性能。由此可見，雖然熒光碳點本身容易被細胞攝取，但是通過簡單的鈍化步驟及表面基團修飾或設計，可以使其被腫瘤細胞特異性攝取。這種主動靶向行為，結合實體瘤的高通透性和滯留效應這一被動靶向更能夠起到靶向診斷和治療作用。關于碳點靶向腫瘤細胞并且成像的例子不勝枚舉，這一性能具有至關重要的診斷治療價值，尤其在腫瘤細胞與正常細胞難以區分時，在外科的術中切除及獲得腫瘤的實時信息方面具有非凡的臨床指導意義以及應用價值。除此之外，在生物成像方面，熒光碳點以其獨特優良的熒光性能得到了廣泛的應用，例如通過實時監測熒光檢測體內藥物的運輸及分布。值得注意的是，量子點還可以用于標記干細胞，觀察其分化、轉移、蛋白分布等［14］。

2.2作為生物傳感器利用熒光碳點可以檢測生物體內各種生化物質成分的變化過程，具有生物相容性好、簡單易行、靈敏度高、背景干擾小、可檢測種類多等特點［15］。例如，用涂硼熒光碳點進行葡萄糖水平的檢測，不但能夠達到實際應用的標準，并且具有靈敏度高，干擾小的優點［16］。再如，細胞內銅離子穩態的改變最終會產生神經退行性病變，生理和病理情況下的細胞內的銅離子濃度有所不同，因此，對銅離子濃度的監測至關重要。有學者通過制備CQD-TPEA這一熒光碳點實現了對胞內銅離子的監測，并且具有較高特異性和長時間穩定性［17］。

2.3作為藥物/基因載體量子點藥物載體因能夠減少藥物的毒性、提高藥物效能、增加體內循環時間，靶向或控制藥物的釋放而逐漸取代病毒載體成為目前的研究焦點。熒光碳點，這一新興量子點，其表面一般因小尺寸效應的存在，比表面積增加，表面可修飾官能團豐富，可以共價修飾的方式作為藥物基因載體、控藥釋放以及實現監測追蹤等功能，在疾病的診斷和治療中發揮至關重要的作用［18］。國內外學者對熒光碳點載抗腫瘤藥物的研究已取得一定進展。有學者將多柔比星［19］、奧沙利鉑［20］等抗腫瘤制劑與碳點結合形成熒光碳點-抗腫瘤藥復合物，載藥效率可高達86%，該載藥碳點不但可以以監測熒光的方式進行追蹤，并且仍能保留原有的抗腫瘤細胞作用成為高效的藥物載體，提示了熒光碳點在抗腫瘤治療中的應用前景，因此也提示了熒光碳點載藥和載基因應用的可能性。除了共價修飾，也可以通過靜電吸引實現載藥:將帶負電的碳點與帶正電的介孔二氧化硅納米顆粒通過靜電引力結合而富于表面，設計成生理溫度下智能pH響應的控釋系

統。介孔二氧化硅內含藥物，在中性條件下被表面的熒光碳點封在二氧化硅內部，在酸性條件下(利用腫瘤細胞具有外堿內酸的特殊性)得以釋放，從而靶向發揮作用［21］。這也說明熒光碳點在環境響應性生物材料方面具有其一定的應用前景。

熒光碳點在作為納米藥物載體方面具有卓越的優越性，但是在作為DNA載體方面，由于熒光碳點與基因結合后在運送過程中立即釋放使其應用受到了限制。有學者在這一方面進行了研究，用聚醚酰亞胺對熒光碳點進行了表面鈍化使其功能化，發現聚醚酰亞胺接枝的熒光碳點可以在較低的質量比下通過靜電吸引濃縮帶負電的DNA，而且能夠增強包裹的熒光碳點的熒光性能，這主要是因為其表面的聚醚酰亞胺陽離子聚合物層能夠介導質粒DNA的轉染。Wang等［22］用Alkyl-PEI2k對熒光碳點進行鈍化處理，通過體內外各項實驗證明其具有穩定結合、保護、運送質粒DNA和siRNA的能力，成為極其具有前景的安全、高效、可監測基因載體，值得注意的是該熒光碳點對19-23bp的siRNA運載效果較差。

熒光碳點載體的可控釋放性能在抗菌藥物的使用上也具有應用潛能。將熒光碳點與廣譜抗生素鹽酸環丙沙星共價結合獲得載藥碳點［23］，其結合率高于90%，抗生素在24 h內于熒光碳點表面持續可控地釋放，且能很好地發揮抑制革蘭氏陽性菌和陰性菌活性的作用。這一應用策略對于應對目前濫用抗生素使細菌耐藥的狀況有特殊意義。

2.4其他眾所周知，阿爾茲海默癥與Z-DNA具有密切的聯系，因此DNA的B-Z轉換在DNA納米技術中引起學者們的關注。研究表明，熒光碳點可以通過與DNA大溝結合減少B-DNA向Z-DNA的轉換，但這只是在體外環境下的實驗結果，有待進一步的研究［24］。但這一發現無疑擴展了碳點在DNA納米技術中的應用范圍。

單純的熒光碳點(即不作為藥物或基因載體時)對細胞的影響仍存在許多可能性，比如一些熒光碳點具有直接抑制腫瘤細胞生長或殺傷腫瘤細胞的功能。例如，有學者從姜中提取出碳點，發現其對人肝癌HepG2細胞有特異性的殺傷作用，并與ROS的大量產生有關，而且得出其主要功能部分是其原料——姜黃素。有趣的是，該熒光碳點對另兩種腫瘤細胞A549(人肺腺癌細胞)和Hela(人宮頸癌細胞)并無明顯的殺傷作用，說明其對細胞具有高度選擇性［25］。Liu等［26］發現，由檸檬酸和RNase A微波法合成的熒光碳點能夠抑制并殺傷MGC-803細胞(人胃癌細胞)，但具體機制尚未明確，可能與制備熒光碳點的原料有密切關系，有待進一步探索，另外，值得注意的是該熒光碳點能夠進入細胞核。

3　展望

隨著納米顆粒在組織工程學的蓬勃發展，人們發現通過改變納米顆粒的表面物理化學性能，能夠對干細胞的分化、衰老和病理性組織的更新和再生產生影響［27］。許多碳納米材料，如單壁或多壁的碳納米管材料已被證實具有促進干細胞成骨分化從而促進骨組織形成的作用［28］，因而可以推測熒光碳點作為碳納米材料可能具有同樣的功能。另外，已有研究表明，小尺寸的納米金顆粒水溶液可以通過與胞質內蛋白結合，進而激活MAPK信號通路并促進干細胞的成骨向分化［29］。這一研究結果在納米材料的應用方面有重要的提示意義，意味著納米材料本身，即在不作為載體的情況下，可以通過受體蛋白對細胞核產生作用，并進一步產生促進骨組織修復的作用，再次提示熒光碳點單獨應用的可能性。值得注意的是，納米材料的理化性質對其功能往往有著重要影響，包括濃度、大小、形狀、表面性能、表面電荷等［14］。當然，制備原料的選擇也是至關重要的，這些因素在進行碳點的選擇和修飾中都應加以注意。

熒光碳點具有諸多優點，與傳統量子點相比，熒光碳點展現出的良好生物相容性，具有逐步取代傳統量子點的可能。但碳點也有一定的缺點:①大多數熒光碳點的激發波長處于紫外波段，紫外光對組織的穿透性差，將限制深層組織的光學成像，而且幾乎所有生物組織對于紫外光都會產生自發熒光，產生干擾。而近紅外光能夠深層穿透［30］，因此需要進一步研制在近紅外光區發光的碳點。②關于熒光碳點的研究并不全面:比如上述關于碳點對機體免疫系統的影響的研究少且范圍局限，只有對鼠的實驗監測結果并不能保證人類使用的安全性，而免疫系統作為人類的防御系統至關重要，因此熒光碳點對人體免疫學影響的研究應當引起注意。③在臨床應用方面的研究較少，比如熒光碳點的有效給藥方式尚缺少文獻報道，這也是目前將其用于治療疾病亟待解決的問題之一。另外，不同的給藥方式下碳點的血、尿清除速率不同，相關研究將為下一步的研究奠定基礎。

熒光碳點作為新興的量子點依舊具有值得期待的開發潛能，相信隨著不斷研究和發展，在不遠的將來會對醫學領域產生深遠影響。

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收稿日期:( 2015-05-08)

通信作者:孫宏晨，E-mail: hcsun@mail.jlu.edu.cn

基金項目:國家自然科學基金資助項目(81320108011，81271111)。

文章編號:1002-266X(2015)36-0089-04

文獻標志碼:A

中圖分類號:R943

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.36.036