TRAF2基因轉染乳腺癌細胞MCF-7增殖情況觀察

張曉麗，溫志鋒，米小軼( 沈陽市婦嬰醫院生殖中心，沈陽000;中國醫科大學附屬第一醫院)

TRAF2基因轉染乳腺癌細胞MCF-7增殖情況觀察

張曉麗1，溫志鋒2，米小軼2
( 1沈陽市婦嬰醫院生殖中心，沈陽110001;2中國醫科大學附屬第一醫院)

摘要:目的觀察TRAF2基因轉染乳腺癌細胞MCF-7增殖情況。方法轉染hTRAF2pLPCX-HA-Flag/P874質粒于MCF-7細胞，以空質粒pcDNA3作為陰性對照。MTT法檢測細胞增殖能力，Western blotting法檢測細胞中NF-κB的核表達。結果轉染空質粒、轉染hTRAF2pLPCX-HA-Flag/P874質粒的MCF-7細胞48 h的吸光度值分別為0.313±0.019、0.606±0.007，72 h分別為0.708±0.193、1.332±0.075，96 h分別為0.936±0.203、1.462± 0.231，兩者比較，P均＜0.001。轉染空質粒、轉染hTRAF2pLPCX-HA-Flag/P874質粒的MCF-7細胞NF-κB的核表達分別為0.789±0.236、1.169±0.369，兩者比較，P＜0.01。結論TRAF2基因轉染乳腺癌細胞MCF-7增殖能力增強。

關鍵詞:乳腺腫瘤;腫瘤壞死因子受體相關因子2;核轉錄因子κB;細胞增殖

腫瘤壞死因子受體相關因子( TRAF)是一類重要的胞質銜接蛋白，它能夠與腫瘤壞死因子受體( TNFR)超家族成員等多種細胞表面受體的胞質部分結合，從而調節正常以及腫瘤細胞的增殖、存活、凋亡。目前已經發現7種TRAF家族成員( TRAF1 ～7)，其中TRAF2是這一信號調節網絡的中心環節。TRAF2接受TNF-α的刺激后，可以調節JNK-c-JUN、Iκκ/NF-κB信號級聯反應的激活［1］。且TRAF2可以與TRAF1、TRAF3、TRAF4及TRAF6相互結合［2～5］。但有關TRAF2在腫瘤中的具體作用機制還不十分清楚，因此本研究觀察了TRAF2基因轉染乳腺癌細胞MCF-7增殖情況。

1　材料與方法

1.1細胞培養人正常乳腺上皮細胞系MCF-10A、人乳腺癌細胞系MCF-7購自美國菌種保藏中心。MCF-10A用DMEM/F12( 1∶1)培養基培養，并添加5%馬血清、10 μg/mL胰島素及20 ng/mL表皮生長因子。MCF-7用添加10%標準胎牛血清及100 U青鏈霉素的DMEM培養基培養。所有上述細胞均在37℃、5%CO2的培養箱中培養。

1.2 MCF-7細胞TRAF2基因轉染方法hTRAF2pLPCX-HA-Flag/P874序列購自Addgene公司(美國)。Attractene質粒轉染試劑購自Qiagen公司(德國)。根據制造商說明書進行轉染實驗。空質粒pcDNA3作為陰性對照。

1.3 TRAF2、NF-κB蛋白檢測采用Western blotting法檢測MCF-10A及MCF-7中的TRAF2及NF-κB蛋白。采用美國Pirece公司的NE-PER核質蛋白抽提試劑盒，根據說明書進行抽提細胞核蛋白。檢測轉染空質粒、轉染hTRAF2pLPCX-HA-Flag/P874質粒后MCF-7細胞中NF-κB的核表達。細胞經預冷的PBS清洗3次，加入適量細胞裂解液，提取總蛋白。加樣，上樣蛋白量為50 μg。聚丙烯酰胺瓊脂糖凝膠電泳，轉印至硝酸纖維素膜后，室溫下5%正常小牛血清封閉2 h，將膜放在含相應一抗的封閉液中［抗TRAF2( 1∶1 000)、NF-κB( 1∶500)、βactin( 1∶1 000)、Lamin B1( 1∶500)］，4℃孵育過夜，與相應二抗室溫孵育2 h，膜取出后加入ECL顯色液。自動電泳凝膠成像分析儀采集結果，進行灰度值測定。實驗重復3次以上，取平均值。

1.4 TRAF2基因轉染MCF-7細胞增殖情況采用MTT法。取處于對數生長期的MCF-7細胞轉染空質粒或hTRAF2pLPCX-HA-Flag/P874質粒。MCF-7細胞用0.25%的胰蛋白酶消化后制成單細胞懸液(細胞密度3×105個/mL)，分別接種于4個96孔板培養板，細胞培養24、48、72、96 h后分別加入MTT( 5 mg/mL) 20 μL，繼續孵育4 h后，每孔加入150 mL DMSO溶解結晶，選擇波長550 nm，在酶聯免疫( ELISA)檢測儀上測定各孔吸光度。實驗重復5次，結果取平均值。

1.5統計學方法采用SPSS17.0統計軟件。計量資料以珋x±s表示，組間比較用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

MCF-10A、MCF-7細胞系中TRAF4蛋白表達分別為0.385±0.123、0.723±0.223，兩者比較，P＜0.01。轉染空質粒、轉染hTRAF2pLPCX-HA-Flag/P874質粒的MCF-7細胞，48 h的吸光度值分別為0.313±0.019、0.606±0.007，72 h分別為0.708± 0.193、1.332±0.075，96 h分別為0.936±0.203、1.462±0.231，兩者比較，P均＜0.01。轉染空質粒、轉染hTRAF2pLPCX-HA-Flag/P874質粒的MCF-7細胞NF-κB的核表達分別為0.789±0.236、1.169±0.369，兩者比較，P＜0.01。

3　討論

TNF誘導細胞凋亡的作用是通過許多信號分子共同參與完成的一個網絡工程，其中TRAFs家族蛋白，尤其是TRAF2，是這一信號調節網絡的中心環節。TRAF2在接受TNF-α的刺激后，可以調節JNK-c-JUN以及Iκκ/NF-κB信號級聯反應的激活。最近報道指出，由凋亡抑制因子( cIAP1及cIAP2)、TRAF2、TRAF3、JNK組成的復合物在非經典NF-κB激活中起重要作用。TRAF2募集cIAP1及cIAP2，激活cIAPs，并激活K63相關泛素化作用［6～8］。基因敲除實驗發現，TRAF2可以抑制TNF-α誘導的細胞凋亡。另一方面，氧化應激所導致的TRAF2磷酸化能顯著促進由于Iκκ激活延長以及JNK激活時期縮短所導致的細胞存活［9～12］。

本研究發現，乳腺癌細胞MCF-7中的TRAF2表達高于正常乳腺上皮細胞MCF-10A，表明TRAF2可能與乳腺癌細胞的增殖有關。本研究還發現，TRAF2基因轉染乳腺癌細胞MCF-7后可顯著增強細胞NF-κB的核轉位，并且明顯促進該細胞的增殖能力。TRAF2在胰腺癌細胞系中可與CD40相結合，并能促進JNK的激活和NF-κB報告基因的活化［13］。推測TRAF2在MCF-7細胞中可能通過某種方式激活NF-κB的核轉位從而促進該細胞的增殖。

綜上可見，TRAF2在乳腺癌細胞中高表達，TRAF2基因轉染乳腺癌細胞MCF-7增殖能力增強。這可能是由于TRAF2可通過激活NF-κB的核轉位促進乳腺癌細胞的增殖，其具體的作用機制以及其中是否還有其他TRAF家族成員的參與還需要我們進一步探討。

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收稿日期:( 2015-05-09)

文章編號:1002-266X( 2015) 31-0023-02

文獻標志碼:A

中圖分類號:R737.9

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.31.008