單核苷酸多態性與2型糖尿病易感基因相關性的研究進展

楊國宗綜述，楊麗陽審校

(漳州市中醫院檢驗科，福建 漳州363000)

近年來，隨著經濟發展和生活方式的改變，2型糖尿病(T2DM)發病率在我國呈現逐漸升高的趨勢。T2DM是一種遺傳因素和環境因素共同作用而形成的多基因遺傳的復雜性疾病，并以胰島素分泌受損和(或)胰島素抵抗為主要的臨床特點，其遺傳方式屬于常染色體多基因隱性遺傳，由于異常基因的遺傳使后代具有糖尿病易感性。隨著單核苷酸多態性(SNP)分析技術的發展以及全基因組關聯研究結果的相繼報道，至今已發現許多常見基因變異與T2DM密切相關，但其病因、發病機制未能完全闡明。據統計，目前全球糖尿病患者約3.66億，估計到2030年將有5.52億，其中T2DM 至少占95%以上[1]，因此利用高效率、高通量、低成本的SNP分析技術來發現糖尿病易感基因并對其進行相關研究，為T2DM的早期預測并及時做好防治措施具有非常重要的意義。我們以SNP為線索，將其在T2DM發病機制研究中的應用進展作一綜述。

1 SNP概況

SNP是指由單個核苷酸變異所引起的DNA序列多態性。在遺傳學分析中，SNPs作為第三代遺傳標記，在科研中得以廣泛應用。人類染色體大量存在SNP位點，近年來的研究發現有些SNP引起包括糖尿病、腫瘤等在內的各種疾病相關基因表達,有些SNP不直接導致疾病基因的表達，但由于它與某些疾病的致病基因相鄰，也可以作為某些疾病的重要標記，由于存在著 SNP，造成人類對有些疾病的易感性、對藥物反應性及耐受性的個體差異。另外，SNP具有的高頻性、穩定性特征對疾病發生的相關因素分析也是非常重要[2]。隨著現代技術的進步，利用SNP發現疾病相關基因突變比通過家系遺傳譜的研究容易得多。由于SNP主要是二等位多態性，在基因組篩選中SNPs只需+/-的分析，而不必分析片段的長度，這有利于篩選或檢測SNPs的自動化，達到快速、規模化篩查的目的。SNPs在人群中幾乎為雙等位基因標記，其等位基因頻率容易估計，同時也易于進行基因分型方面研究。

2 SNP的主要檢測平臺

2.1 低通量 包括限制性酶切片段長度多態性(RFLP)、單鏈構象多態性(SSCP)、DNA 測序法、變性高效液相色譜(DHPLC)等，其中以DHPLC技術為主要代表，它是在單鏈構象多態性和變性梯度凝膠電泳基礎上發展起來的一種新的雜合雙鏈突變檢測技術，其主要原理是先對目標核酸片段PCR擴增，部分加熱變性后，含有突變的DNA序列由于錯配堿基與正常堿基不能配對而形成異源雙鏈，通過帶正電荷的流動相將帶負電荷的DNA分子吸附到固定相上，在不完全變性的條件下，含錯配堿基的雜合異源雙鏈比完全配對的同源雙鏈和固定相的親和力弱，更易從分離柱上洗脫下來，從而達到分離的目的。實驗樣本中SNPs是否存在，則最終表現為色譜峰形或數目差異，進而檢測目的DNA的堿基變異，一般與直接測序法合用。在臨床應用過程中，DHPLC技術篩查未知SNPs具有檢測效率高、成本低、易于操作和快速準確等優點，因此在人功能基因SNPs研究中得到較好應用[3]。值得注意的是，DHPLC檢測也有一些不足，首先是對所用的試劑和環境要求較高，容易產生誤差；其次，該技術不能檢測出純合突變。總的來說，該技術很大地促進了新突變位點的發現，并對了解疾病發生發展機制，確定藥物研發方向做出了重要貢獻。

2.2 中高通量 主要有SNPstream技術、SNP lexTM Assay、基因芯片技術、MassARRAY-IPLEX技術。基因芯片技術有著信息量大、自動化、成本低、有一定的特異性等優點，但其檢測靈敏度低、重復性較差、分析范圍窄等不足。MassArray飛行時間質譜生物芯片系統是為基因組學研究提供兼顧靈敏度和特異性的中高通量技術平臺，是目前唯一采用質譜法進行直接檢測的設備。MassARRAY-IPLEX SNP檢測系統基本原理為基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOFMS)技術[4]，該技術是Sequenom公司推出的世界領先的基因分析工具，通過引物延伸或切割反應與靈敏、可靠的MALDITOF質譜技術結合，實現基因分型檢測，分型結果準確性高，因此在SNP的基因分型具有重要的意義。其主要特點是序列特異引物在SNP位點上延伸1個堿基，然后將制備的樣品分析物與芯片基質共結晶后在質譜儀的真空管經瞬時納秒強激光激發，基質將吸收的激光脈沖能量轉移給待分析樣品，按質荷比加以分離。離子捕獲儀收集并儲存脈沖信號，并對其進行質譜分析，通過比較A、T、G和C的信號強度及毗鄰信號間分子量差異可得出模板序列的一維信息，從而實現SNP分型的目的。MassARRAYTM系統反應體系為非雜交依賴性，不存在潛在的雜交錯配干擾，不需要各種標記物，其采用的高密度SpectroCHIPTM點陣芯片可以快速完成多重性鑒定，具有很大的靈活性，高度的準確性，在大量樣本的高通量檢測中得到較廣的應用[5]。

2.3 高通量 包括高溫連接酶檢測反應 (LDR)、Taqman探針技術、高分辨熔解曲線(HRM)基因突變檢測/分型系統等。新型LDR寡核苷酸芯片利用了LDR原理，即當高溫連接酶檢測到DNA與互補的兩條寡聚核苷酸接頭對應處存在著基因點突變類型的堿基錯配時連接反應就不能進行，從而實現對基因多態性位點的識別。利用該原理，該技術大大提高了分型準確性，從而使得T2DM易感基因分型得到更好的應用。Taqman探針技術也是目前應用較為廣泛的一種分析技術，該技術的優點在于反應在PCR過程中進行，無需分離或洗脫過程，從而減少了可能的PCR污染。此外，擴增產物分析具有簡便、快捷、準確、無需電泳，提高了實驗速度。HRM基因突變檢測/分型系統在5分鐘即可完成96/384孔板PCR產物樣品突變檢測，尤其用于測序前的大規模突變篩查及基因分型工作，使測序的工作量降低為原來的1%。

3 SNP在T2DM易感基因篩選中的應用

目前，國際上共報告了40多個糖尿病易感基因。Scott LJ等[6]通過對SNPs的關聯分析后，發現了4個與T2DM有關的易感基因，它們分別是定位在9號染色體上的CDKN2A、CDKN2B基因，以及定位在 3號染色體上的 IGF2BP2、CDKALl基因。我國也開展了相關易感位點的研究，報告了幾個候選易感基因。早在2003年，駱天紅等[7,8]通過收集大量T2DM患病同胞家系，利用人類多態性研究中心公布的微衛星位點，對這些家系進行全基因組掃描和連鎖分析，發現了中國漢族人T2DM的一些易感基因位點，他們還對102個華東地區漢族人T2DM家系 (其中包括糖尿病患者282人，74個家系有2個糖尿病同胞，18個家系有3個糖尿病同胞，10個家系有4個糖尿病同胞)的SNP關聯分析和全基因組掃描研究，結果顯示這些人的9號染色體上D9S171、D9S175同T2DM有連鎖傾向。Wen J等[9]也證實了以往發現的另外6個T2DM易感基因，分別是 TCF7L2、SLC30A8、HHEX、PPARG、KCNJl、FTO 基 因 ， 這 些 基 因 與T2DM發生和發展的風險性增高相關。后來，我國有學者研究發現SLC30A8基因與中國漢族人T2DM和空腹血糖受損及糖調節受損相關，SLC30A8基因CC基因型患T2DM的風險顯著增加[10,11]。對于血糖的調節因子胰島素及其受體的相關基因研究中，Malecki等[12]人發現2號染色體長臂近末端處D2S126附近的糖尿病候選基因NEURODl雜合突變同T2DM相關，該基因編碼的蛋白同HLH蛋白E47形成異二聚體后，可同胰島素基因啟動子上的E-box序列結合，從而調控胰島素的分泌。另一個重要的候選基因胰島素受體底物1基因，由于該基因編碼的蛋白質在胰島素信號轉導過程中起重要作用，其某些特殊等位基因同T2DM相關。糖代謝中與血脂轉化因素相關基因研究中，焦紅肖[13]等對天津地區1463名無血緣關系的人群研究發現了5個SNP位點與T2DM顯著相關，分別為 CDKN2A/B、CDKAL1、LPHN3、IGF2BP2、ABCG2基因。孫志連[14]等對T2DM患者的脂聯素基因第45位點單核苷酸多態性(SNP45)分析發現糖尿患者群中G等位基因多見，攜帶等位基因G的患者血清甘油三脂較高，提示脂聯素基因SNP45多態性與T2DM發病及甘油三脂有關。韓景銀[15]等研究發現T2DM患者存在血清脂聯素、內脂素水平的異常表達，與T2DM頸總動脈IMT值有著顯著相關性。

近年來，SNP在T2DM腎病的易感性方面的相關研究比較多。T2DM并發腎病的相關易感基因的研究主要針對T2DM患者微血管病變的各高危因子，包括糖、脂代謝異常相關基因，腎素-血管緊張素系統的基因及其他遺傳因素。Gosek K等[16]研究了444例T2DM患者，發現AR基因C-106T多態性是血糖控制不良T2DM腎病的危險因子。McKnight AJ等[17]研究了GREM1基因變異與DN的關系，發現GREM1變異型rs1129456與糖尿病腎病相關。Naresh VV等[18]研究了ACE基因I/D多態性與T2DM腎病關系，研究結果顯示DD純合型與2型糖尿病腎病有關。李頎等[19]對脂氧合酶超家族成員之一ALOX12的基因多態性進行研究，在北方漢族人群中未發現ALOX12基因多態性與T2DM、DN有關。所研究這些可能的易感基因，還有待進一步確定。目前對于T2DM及DN候選基因的研究中存在一部分有爭議或矛盾的結論，原因可能與采集的樣本過小、種族不同、地域不同、樣本不同質性、技術方法不同有關。

總之，隨著高效、高通用、低成本的SNP檢測技術不斷被開發和大規模應用，不同地區不同種族人群的SNPs研究增多，使SNPs數據庫的日趨健全，越來越多與T2DM相關的SNPs被發現及T2DM易感基因被確認，將有助于對T2DM及DN發病機制的深入了解。通過先進的高通量分析技術對T2DM患者SNP檢測的應用，有助于建立疾病基因分型方法為T2DM的預防提供理論依據，以便早期發現T2DM高危人群，為T2DM患者提供新的預防和治療選擇,同時對實現DN早期預測和防治也具有重要意義。

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