蛋白質轉導結構域的研究概況

湖南食品藥品職業學院（410208）賴利平 潘偉男 鄧水秀 鄭慧芝

湖南省長沙市雨花區圭塘街道長重社區衛生服務站（410014）劉瑛

細胞膜脂質雙分子層具有非滲透特性，它阻礙了一些多肽、蛋白質、核酸等生物活性物質及高分子復合物進入細胞，這些天然屏障的存在也影響了一些生物學機制的研究和某些疾病的防治。近年來，研究發現的一些能攜帶生物活性物質并有效穿過多種哺乳動物細胞膜的小分子陽離子多肽——蛋白質轉導結構域（protein transduction domain，PTD），成功開啟了生物活性大分子向細胞內轉運的大門。

1988 年Green和Frankel等首次報道了人類免疫缺陷病毒（HIV）的轉錄反式激活蛋白（TAT）可跨膜轉導入哺乳動物的細胞內，并發現進入細胞的TAT蛋白定位于細胞核，與啟動子結合后，反式激活HIV病毒轉錄。1994年Fawell等報道了TAT與β-半乳糖苷酶、辣根過氧化物酶、RNA酶、蛋白毒素等異源蛋白質共價結合，可共同轉導至細胞內，并證實TAT多肽是一種潛在的細胞穿膜轉導劑。進一步研究發現，TAT蛋白中存在一個富含堿性氨基酸的、帶正電荷的多肽片段（第48～60位氨基酸）是TAT穿膜的功能序列，此多肽與蛋白質轉導密切相關，故稱為PTD或細胞穿膜肽（cell penetrating peptide，CPP）。隨著研究的不斷深入，又發現了一些高效PTD，如黑腹果蠅觸足肽（Antp43-58）、單純皰疹Ⅰ型病毒轉錄調節蛋白（HSV-1 VP22）及人工合成的多聚精氨酸、PTD-3、PTD-5和CADY等[1][2]。這些PTD大多是病毒蛋白的核定位序列，能穿透生物膜，具有天然的DNA親和力。

與其他生物大分子的轉運方式相比，PTD轉導作用具有許多獨特之處[3]：①PTD不僅可以轉導酶、轉錄因子、單克隆抗體等多肽和蛋白質，也可將與其偶聯的小分子有機化合物、寡核苷酸、DNA、噬菌體、脂質體和納米級鐵珠等多種大小不同的其他物質轉導入細胞或穿過血腦屏障，且大部分的多肽和蛋白質導入細胞后仍保持其生物活性。②PTD幾乎能將介導的外源分子導入所有的哺乳動物細胞，甚至包括對DNA轉染和逆轉錄病毒感染都不起作用的破骨細胞與外周血單核細胞。③PTD轉導以濃度依賴性方式進行，轉導效率高，幾乎可以達到100%，并且轉導作用迅速，在培養基中加入PTD后5min就可在細胞內檢測到，甚至還能達到細胞最大濃度。④PTD轉導對細胞幾乎沒有毒性，不破壞細胞膜和血腦屏障，不被肝和脾的巨噬細胞吞噬，也不被溶酶體降解。基于上述特點，PTD在基礎研究和應用研究中顯示出明顯優勢和廣闊前景。

PTD均為帶正電荷的、長短不等的小分子多肽，可攜帶多種生物活性物質入膜，其轉導穿膜機制存在四種理論學說：①非經典轉導學說。研究發現PTD穿膜過程與受體介導無關，且使用線粒體呼吸鏈代謝抑制劑（疊氮鈉、魚藤酮等）后，PTD轉導不受影響，提示此作用不依賴能量，為非主動轉運。另有研究報道，PTD轉導在4℃時的轉導效率與37℃時基本相同，而低溫時正常的胞吞作用已經失活，提示PTD轉導不以經典的胞吞形式進行。②非經典胞吞作用學說。研究發現PTD轉導作用因加入一些細胞內吞作用抑制劑（秋水仙素、紫杉醇、氯喹等）而減弱，故認為這種不同于經典胞吞作用的途徑也存在于PTD轉導過程中。③內吞攝取機制學說。研究表明在細胞內，PTD及其復合物存在于內吞體中，可能是通過細胞膜快速靜電作用攝取PTD及其復合物，再內吞到細胞中。④細胞攝取機制學說。研究推測PTD的穿膜機制可能是陽離子多肽與生物膜上的陰離子物質（糖胺聚糖等）形成中性復合物，進一步激活了細胞攝取機制[4]。

PTD通常由10～16個氨基酸組成，共同結構特點是富含精氨酸殘基，其氨基酸序列即一級結構對PTD穿膜功能非常重要，除此之外，它們在序列和結構上很少具有相似性。研究發現，PTD的跨膜轉導過程可分為三個步驟：①PTD通過靜電相互作用結合在細胞膜表面，PTD氨基酸序列上的正電荷和包膜表面的負電荷相互吸引，再通過靜電作用促使PTD結合到包膜表面。②在第一步的靜電相互作用下，PTD攜帶偶聯的活性物質以前述的四種可能機制轉導入膜，多聚精氨酸和TAT中精氨酸的胍基有助于PTD跨膜轉導。③PTD導入的活性物質在細胞內發揮生物學效應。隨后PTD在細胞內代謝分解，并可在細胞周圍介質中檢測到它們的降解產物。

蛋白質轉導建立了一條直接、快速、有效的新型細胞轉運系統。PTD的應用打破了蛋白質常規只能通過細胞表面受體和信號轉導途徑，將其所攜帶的生物信息傳遞至細胞內的經典規律，開辟了蛋白質治療的新領域和新路徑。蛋白質轉導技術也必將成為蛋白質功能研究和細胞內藥物運輸的有力工具，將在疾病防治、基因治療和新藥研發等方面發揮更重要的作用。