泰州地區鴨源大腸桿菌的分離鑒定與耐藥性試驗

劉玉華　陳光明　方向紅　戴麗紅

摘要：以泰州地區15羽臨床疑似大腸桿菌病病死鴨為病料進行病原分離培養、革蘭氏染色鏡檢、生化試驗，分離鑒定出13株大腸桿菌。對分離菌進行藥敏試驗發現，13株大腸桿菌對頭孢噻呋的耐藥率最低，對鏈霉素的耐藥率最高。對氟苯尼考、阿米沙星、大觀霉素的耐藥率相對較低（分別為154%、231%、308%，而對大多數抗菌藥物則表現出較強的耐藥性，大腸桿菌多重耐藥現象非常普遍，大多數大腸桿菌都是5耐、6耐、7耐甚至8耐。

關鍵詞：鴨；大腸桿菌；分離鑒定；耐藥性試驗

人和動物腸道內均有大腸桿菌存在，正常條件下大多數大腸桿菌是不致病的共棲菌，在特定條件下可致病。少數大腸桿菌與人、[JP2]動物的大腸桿菌病密切相關[1]。致病性大腸桿菌的許多血清型可引起家畜、家禽發病。近年來，隨著江蘇省泰州地區養鴨業的快速發展，鴨大腸桿菌病也愈來愈常見，臨床上主要應用抗菌藥物來預防、治療鴨大腸桿菌病，但大腸桿菌易產生耐藥性，加上養殖戶盲目選用抗菌藥物，造成大腸桿菌耐藥性逐年嚴重，給養鴨業造成嚴重損失。本研究選擇泰州地區臨床疑似大腸桿菌病的病死鴨進行大腸桿菌病的分離鑒定及耐藥性試驗，旨在為選擇有效的抗菌藥物提供參考。

1材料與方法

11材料

泰州地區臨床疑似大腸桿菌病的病死鴨15羽。培養基：麥康凱瓊脂、營養瓊脂、水解酪蛋白瓊脂（MH瓊脂均由杭州天和微生物試劑有限公司生產。葡萄糖、乳糖、甘露糖、麥芽糖、尿素、檸檬酸鹽、蛋白胨水、硫化氫等生化微量鑒定管（杭州天和微生物試劑有限公司，甲基紅試驗、吲哚試驗、V-P試驗等試驗所用試劑均為自制。藥敏紙片：四環素、氨芐西林、阿莫西林、慶大霉素、氧氟沙星、環丙沙星、氟苯尼考、磺胺異[XC1TIF]唑、鏈霉素等9種藥敏紙片均由杭州天和微生物試劑有限公司生產。頭孢噻呋、大觀霉素、阿米卡星（廣州市輝康生物科技有限公司。大腸桿菌（ATCC25922購于中國普通微生物菌種保藏管理中心。

12方法

對15羽臨床疑似大腸桿菌病死鴨剖檢，從肝臟無菌取病料，劃線接種于麥康凱瓊脂平板，37 ℃培養18 h，挑取粉紅色、邊緣光滑的可疑菌落，用麥康凱瓊脂進行純化，觀察平板上的菌落特征，并挑取紅色菌落涂片、革蘭氏染色、鏡檢。純化后可疑菌落接種營養瓊脂平板進行純化，37 ℃培養18 h，用于生化試驗、藥敏試驗。

121生化試驗

取瓊脂平板上的菌落按常規方法進行吲哚、甲基紅、V-P、檸檬酸鹽、葡萄糖、乳糖、甘露糖、麥芽糖、尿素酶、硫化氫等生化試驗，觀察并記錄結果。

122藥敏試驗

以大腸桿菌（ATCC25922為標準菌株，采用紙片擴散法（-B法測試大腸桿菌對氨芐西林、阿莫西林、頭孢噻呋、慶大霉素、大觀霉素、阿米沙星、鏈霉素、四環素、氟苯尼考、磺胺異[XC1TIF]唑、環丙沙星、氧氟沙星等12種抗菌藥物的敏感程度。用接種環挑取純培養的大腸桿菌單菌落 4～5個，置于滅菌生理鹽水管中，校正菌懸液的濃度至05麥氏比濁單位（相當于15×108 CFU/mL。用滅菌棉拭子蘸取少量懸液，在MH瓊脂表面均勻涂抹接種3次，每次使平板旋轉60°，最后沿平板內緣涂抹1圈。蓋上平板，室溫靜置 3～5 min，鑷子灼燒滅菌后夾取藥敏紙片貼于MH瓊脂表面。每個平板貼6片藥敏紙片，各藥敏紙片間距離不少于 24 mm，置于35 ℃恒溫箱中培養18 h。觀察藥敏紙片周圍有無抑菌圈形成，測量抑菌圈直徑（表1。

人和動物腸道內均有大腸桿菌存在，正常條件下大多數大腸桿菌是不致病的共棲菌，在特定條件下可致病。少數大腸桿菌與人、[JP2]動物的大腸桿菌病密切相關[1]。致病性大腸桿菌的許多血清型可引起家畜、家禽發病。近年來，隨著江蘇省泰州地區養鴨業的快速發展，鴨大腸桿菌病也愈來愈常見，臨床上主要應用抗菌藥物來預防、治療鴨大腸桿菌病，但大腸桿菌易產生耐藥性，加上養殖戶盲目選用抗菌藥物，造成大腸桿菌耐藥性逐年嚴重，給養鴨業造成嚴重損失。本研究選擇泰州地區臨床疑似大腸桿菌病的病死鴨進行大腸桿菌病的分離鑒定及耐藥性試驗，旨在為選擇有效的抗菌藥物提供參考。

1材料與方法

11材料

泰州地區臨床疑似大腸桿菌病的病死鴨15羽。培養基：麥康凱瓊脂、營養瓊脂、水解酪蛋白瓊脂（MH瓊脂均由杭州天和微生物試劑有限公司生產。葡萄糖、乳糖、甘露糖、麥芽糖、尿素、檸檬酸鹽、蛋白胨水、硫化氫等生化微量鑒定管（杭州天和微生物試劑有限公司，甲基紅試驗、吲哚試驗、V-P試驗等試驗所用試劑均為自制。藥敏紙片：四環素、氨芐西林、阿莫西林、慶大霉素、氧氟沙星、環丙沙星、氟苯尼考、磺胺異[XC1TIF]唑、鏈霉素等9種藥敏紙片均由杭州天和微生物試劑有限公司生產。頭孢噻呋、大觀霉素、阿米卡星（廣州市輝康生物科技有限公司。大腸桿菌（ATCC25922購于中國普通微生物菌種保藏管理中心。

12方法

對15羽臨床疑似大腸桿菌病死鴨剖檢，從肝臟無菌取病料，劃線接種于麥康凱瓊脂平板，37 ℃培養18 h，挑取粉紅色、邊緣光滑的可疑菌落，用麥康凱瓊脂進行純化，觀察平板上的菌落特征，并挑取紅色菌落涂片、革蘭氏染色、鏡檢。純化后可疑菌落接種營養瓊脂平板進行純化，37 ℃培養18 h，用于生化試驗、藥敏試驗。

121生化試驗

取瓊脂平板上的菌落按常規方法進行吲哚、甲基紅、V-P、檸檬酸鹽、葡萄糖、乳糖、甘露糖、麥芽糖、尿素酶、硫化氫等生化試驗，觀察并記錄結果。

122藥敏試驗

以大腸桿菌（ATCC25922為標準菌株，采用紙片擴散法（-B法測試大腸桿菌對氨芐西林、阿莫西林、頭孢噻呋、慶大霉素、大觀霉素、阿米沙星、鏈霉素、四環素、氟苯尼考、磺胺異[XC1TIF]唑、環丙沙星、氧氟沙星等12種抗菌藥物的敏感程度。用接種環挑取純培養的大腸桿菌單菌落 4～5個，置于滅菌生理鹽水管中，校正菌懸液的濃度至05麥氏比濁單位（相當于15×108 CFU/mL。用滅菌棉拭子蘸取少量懸液，在MH瓊脂表面均勻涂抹接種3次，每次使平板旋轉60°，最后沿平板內緣涂抹1圈。蓋上平板，室溫靜置 3～5 min，鑷子灼燒滅菌后夾取藥敏紙片貼于MH瓊脂表面。每個平板貼6片藥敏紙片，各藥敏紙片間距離不少于 24 mm，置于35 ℃恒溫箱中培養18 h。觀察藥敏紙片周圍有無抑菌圈形成，測量抑菌圈直徑（表1。endprint

23藥敏試驗結果

標準菌株大腸桿菌（ATCC25922的抑菌圈直徑在預期范圍內，說明檢測過程正確，可以進行結果判定。

23113株大腸桿菌對12種抗菌藥物的耐藥率

由表3可知，13株大腸桿菌對頭孢噻呋的耐藥率最低，為0，對鏈霉素的耐藥率最高，為923%。對氟苯尼考、阿米卡星、大觀霉素的耐藥率相對較低，對大多數抗菌藥物表現出較強的耐藥性，對阿莫西林、氧氟沙星、環丙沙星、四環素、慶大霉素、氨芐西林、磺胺異[XC1TIF]唑耐藥率分別達462%、538%、615%、692%、692%、769%、846%。

本研究對泰州地區15羽臨床疑似大腸桿菌病病死鴨進行病原分離培養、革蘭氏染色鏡檢、生化試驗，分離鑒定出13株大腸桿菌。對分離菌進行藥敏試驗，結果表明，13株大腸桿菌對頭孢噻呋的耐藥率最低，為0，對鏈霉素的耐藥率最高，為923%。對氟苯尼考、阿米卡星、大觀霉素的耐藥率相對較低，對大多數抗菌藥物則表現出較強的耐藥性，對阿莫西林、氧氟沙星、環丙沙星、四環素、慶大霉素、氨芐西林、磺胺異[XC1TIF]唑耐藥率分別達到462%、538%、615%、692%、692%、769%、846%。13株大腸桿菌的多重耐藥結果表明，大腸桿菌多重耐藥現象非常普遍，大多數大腸桿菌都是5耐、6耐、7耐甚至8耐。由此可知，在泰州地區，治療鴨大腸桿菌病應盡量選用大腸桿菌耐藥率低的藥物如頭孢噻呋、氟苯尼考、阿米卡星等，盡量避免選用耐藥率高的藥物，如鏈霉素[CM（25]、磺胺異[XC1TIF]唑、氨芐西林等。由于大腸桿菌易產生耐藥性，[CM]

[FL]

[H4D]

用藥前最好通過藥敏試驗篩選敏感藥物以保證用藥效果，同時也可減少耐藥性的產生。李新宇報道了泰州地區大腸桿菌對氧氟沙星、頭孢噻呋、頭孢噻肟、阿米卡星、磺胺甲基異[XC1TIF]唑、氟苯尼考、安普霉素等藥物敏感。 陳志華等認為，14 株鴨大腸桿菌中，786 %的菌株對10 種抗菌藥物表現為多重耐藥性。張俊豐等認為，34株雞腸道大腸桿菌均為多重耐藥菌株，最少可對5種藥物耐藥，最多可對8種藥物耐藥[5]。本研究中分離的13株大腸桿菌也產生多重耐藥現象，表明大腸桿菌多重耐藥現象已經非常普遍。張俊豐等認為，細菌耐藥性監測固然重要，但對細菌耐藥機制及耐藥性擴散機制進行研究也同樣重要[5]。徐樹強等研究發現，即便是同一血清型也存在藥敏性差異，這說明耐藥性與血清型無關，耐藥性的產生主要是由于臨床上長期盲目用藥所導致的[6]。陳文靜等認為，導致鴨臨床發病的大腸桿菌耐藥性與血清型、毒力相關基因之間并無相關性[7]。抗生素耐藥性是抗生素應用的結果，禽類養殖中應合理使用抗生素。

[HS23][HT85H]參考文獻：[HT8SS]

[1][（#]陸承平 獸醫微生物學[M] 北京：中國農業出版社，2004：217

[2]陳溥言 獸醫傳染病學[M] 5版北京：中國農業出版社，2006：111-112

[3]李新宇 泰州市部分鄉鎮雞大腸桿菌的分離及藥敏試驗[J] 中國動物保健，2011，13（6：20-22

[4]陳志華，劉富來，繆小群，等 鴨大腸桿菌的藥物敏感性試驗[J] 中國獸藥雜志，2004，38（12：23-25

[5]張俊豐，黃東璋，陳琳，等 雞腸道大腸桿菌的分離鑒定及耐藥性分析[J] 中國畜牧獸醫，2013，40（11：179-184

[6]徐樹強，楊安龍，吳兆林，等 揚州地區雞大腸桿菌的分離鑒定與藥敏試驗[J] 江蘇農業科學，2006（6：330-332

[7][JP2]陳文靜，韓先干，何亮，等 鴨致病性大腸桿菌的分離鑒定及其生物學特性分析[J] 中國動物傳染病學報，2010，18（2：34-40endprint