綿羊卵丘細胞直徑與卵母細胞質量的相關性

古麗米熱·阿布都熱依木　吳陽升　林嘉鵬　汪立芹　張利　蔣香菊　楊楠　唐淑紅　黃俊成

摘要：利用RT-PCR方法，檢測不同直徑綿羊卵泡卵丘細胞中FSHR、EGFR、GHR、bFGF、[WTBX][STBX]CYP19A[WTB][STB]、AMH基因的mRNA表達規律及卵母細胞孤雌激活后胚胎發育的影響，結果表明，大、中、小卵泡卵丘細胞中都有FSHR、EGFR、GHR、bFGF、CYP19A、AMH的mRNA表達，不同直徑卵泡卵丘細胞呈現遞增趨勢，大卵泡卵丘細胞與中小卵泡的卵丘細胞相對表達量差異顯著（P<005；AMH在直徑>50 mm的卵泡卵丘細胞中有所下降。不同大小卵泡卵母細胞經體外培養，結果表明，各卵泡卵母細胞直徑組間成熟率不顯著，隨卵泡直徑的增大卵裂率增加，10～20 mm組與21～50 mm組卵裂率都顯著低于>5 mm組 （P<005，相互間無差異（P>005；囊胚率也呈現逐漸增加的趨勢，卵泡大于50 mm卵母細胞組極顯著高于10～20 mm組（P<001，21～50 mm組（P<005。證實卵丘細胞在綿羊卵母細胞成熟和受精及隨后的胚胎發育過程中起重要作用，卵泡直徑對卵母細胞發育能力產生影響。

關鍵詞：綿羊；卵丘細胞；卵母細胞；RT-PCR

中圖分類號： S8263文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（201412-0236-04

準確判斷卵母細胞的發育能力是提高各類輔助生殖成功的必要條件，從形態學上觀察卵母細胞的厚度及卵丘細胞包裹的緊密程度是評估卵母細胞質量的常用手段[1-2]，這種標準并不能真正預測胚胎的健康，需要從分子角度鑒定預測卵母細胞的功能。卵丘細胞是指在卵母細胞外周并與之進行代謝聯系的顆粒細胞群，對于卵母細胞成熟有極其重要的作用，主要表現在卵丘細胞參與維持卵母細胞減數分裂阻滯、誘導卵母細胞減數分裂恢復并支持卵母細胞細胞質的成熟。卵丘細胞形態和卵丘細胞擴展影響卵母細胞成熟的同時，卵母細胞對卵丘細胞的分化及發育也起著中心調節作用。Li等研究證明卵母細胞對卵丘細胞表型和生存有重要的調節作用，對卵丘細胞增殖、擴散、分化及細胞死亡、類固醇激素分泌有顯著影響[4-5]。最近，Ledda等提出，卵泡液和卵丘細胞可貯存及釋放某些生長因子和某些特定蛋白質，在卵母細胞成熟及胚胎發育過程中按一定順序表達，或通過選擇性地擴散來調節胚胎生長發育[6]。鑒于卵丘細胞與卵母細胞雙邊通信的作用，可以推斷卵母細胞的發育能力變化很可能影響卵丘細胞的表型或者基因的表達，從而通過調節這些基因的表達來提高卵母細胞的發育能力。

本研究通過RT-PCR方法，檢測綿羊不同直徑卵泡卵丘細胞FSHR、EGFR、GHR、bFGF、[WTBX][STBX]CYP19A[WTB][STB]、AMH基因的mRNA表達差異，以推斷這些基因對卵母細胞發育能力的影響，對預測卵母細胞體外發育能力有著重要的意義。RT-PCR方法克服了通過表觀參數而選擇卵母細胞的不可靠性，是一個非侵入性辨別卵母細胞質量的新方法。

1材料與方法

11材料

111藥品及試劑RNeasy Micro RNA提取試劑盒、QIAEX II 瓊脂糖凝膠回收試劑盒，均購于QIAGEN；反轉錄試劑盒RNA LA-PCR（AMV、熒光實時定量PCR試劑盒SYBR Premix Ex Taq、Taq DNA聚合酶、pMD19-T載體，均購于大連寶生物公司；培養用胎牛血清 （FBS、非必需氨基酸（NEAA，均購自Gibco公司；牛血清白蛋白（BSA，購自Bovogen公司。

112綿羊卵泡采集綿羊卵巢來源于新疆維吾爾自治區烏魯木齊當地屠宰場。將采集的卵巢放入37 ℃、含有09%生理鹽水的保溫瓶中，2 h內運回實驗室；用生理鹽水將成年綿羊卵巢洗滌3～4次，置于燒杯內，用注射器抽吸直徑為10～20 mm、21～50 mm和>50 mm的卵泡，收集于盛有抽卵液的90 mm培養皿中。

12方法

121卵母細胞的體外成熟培養將成年綿羊GV期卵丘卵母細胞復合體（COCs按不同直徑移入預先平衡好的成熟液中，在386 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下進行成熟培養，以卵母細胞周圍卵丘細胞擴展程度并排出第一極體作為卵母細胞成熟的標準。

122卵丘細胞的分離在體視鏡下，選取形態完好的COCs放入01%透明質酸酶中，用玻璃管在成熟培養液中反復吹打機械分離卵丘細胞；將含有卵丘細胞的成熟培養液，收集在裝有15 mL PBS的離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，重復1次；將卵丘細胞轉入裂解液中，儲存在-80 ℃冰箱中，待RT-PCR檢測分析。

123卵母細胞孤雌激活挑選有極體且細胞質均勻的卵母細胞，在含5 μmol/L離子霉素（ionomycin的激活液中激活4 min；經2 mmol/L 6-DMAP培養液洗2次，移入含 6-DMAP 的培養液內培養2 h；培養液洗滌3次，移入含有600～700 μL體外培養液的四孔培養板中，CO2箱培養48 h，統計卵裂率，統計6～8 d囊胚率。CO2箱培養條件為 386 ℃、5% CO2、5% O2、90%N2及飽和濕度。

124RNA提取與cDNA逆轉錄合成根據QIAGEN RNeasy Micro it操作步驟提取總RNA，溶解于14 μL RNase-free水，按照大連寶生生物公司（TaaRa反轉錄試劑盒進行反轉錄：RNA 1 μL，隨機引物（表11 μL，加RNAse-free水至 15 μL；置于PCR儀中75 ℃ 10 min，4 ℃ 暫停取出；立即冰浴2 min，加入Inhibitor 05 μL、5×M-MLV buffer 2 μL、dNTP mixture（each 25 mmol/L 75 μL、M-MLV酶 1 μL，42 ℃ 1 h、70 ℃ 10 min，-20 ℃保存備用。endprint