稻瘟病誘導水稻幼苗葉片氧化還原系統的特征譜變化

唐成+陳露+安敏敏+馬愛梅+楊立明+羅玉明

摘要：為了探究水稻幼苗葉片受稻瘟病菌侵染后氧化還原狀態的影響，以水稻感病種質日本晴、抗病種質武運粳7號為材料，接種本區域稻瘟病菌混合小種，測定水稻葉片內超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（OD）、過氧化氫酶（CAT）等活性氧清除酶系的活性，以及丙二醛（MDA） 含量、可溶性蛋白含量。結果表明，稻瘟病菌侵染后水稻抗病材料、感病材料幼苗葉片內SOD、OD、CAT等活性氧清除酶系活性均增強，且MDA含量、可溶性蛋白含量都呈增加趨勢。感病材料日本晴活性氧清除酶系活性的增加幅度明顯大于抗病材料。

關鍵詞：水稻；稻瘟病；活性氧清除酶系；氧化還原平衡

中圖分類號：S4354 文獻標志碼： A

文章編號：002-302（204）2-04-03

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，是全球約40%人口的主食。水稻產量直接影響我國的糧食安全及農業可持續發展。在影響水稻產量的生物脅迫因子中，稻瘟病是造成水稻減產的主要因素之一。稻瘟病在水稻生長發育的各個階段以及各個部位都有發生，主要有苗瘟、葉瘟、穗瘟、節瘟、谷粒瘟等類型，其中比較常見且對水稻危害最嚴重的是葉瘟、穗瘟[-2]。稻瘟病是由稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）引起的一種真菌性病害，主要特征是病斑具有明顯的褐色邊緣，中央灰白色，遇到潮濕環境時，病部呈灰色霉狀物[3-4]。稻瘟病分布廣泛，在全球多個國家、地區都有流行。近幾年來，我國長江中游、西南、東北等稻作區經常發生大面積稻瘟病病害，水稻減產嚴重[5]。在病害流行的年份，一般減產0%～20%，較嚴重可達40%～50%，大發生時甚至顆粒無收[6-7]。稻瘟病因其分布范圍廣、造成危害大而受到廣泛重視[8]。植物抗病的生理生化反應是通過酶催化活動來實現的。正常情況下，植物體內產生的活性氧系統有利于保護植物體，同時也作為第二信使進行信號傳遞，這時活性氧清除酶系、抗氧化系統處于較低水平的動態平衡。一旦植物體受到病害脅迫，會導致植物體內活性氧積累，打破二者的平衡狀態，從而導致活性氧類物質積累，打破植株體內氧化還原系統的平衡，引發植物體的抗病反應。活性氧清除系統包括抗氧化酶類，如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（OD）、過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（AX）等，抗氧化物質有谷胱甘肽（GSH）、抗壞血酸（ASA）、維生素E等[9]。 潘汝謙等研究表明，黃瓜感染霜霉病后體內OD活性迅速升高，且SOD酶活性也明顯上升[0]。魏穎穎等研究表明，煙草與黃瓜花葉病毒互作中過氧化氫酶（CAT）活性顯著上升。本研究以水稻感病材料日本晴、抗病材料武運粳7號為材料，接種江蘇省淮安市本地的稻瘟病菌混合生理小種后，測定水稻葉片內SOD、OD、CAT等活性氧清除酶系的活性變化以及丙二醛（MDA ）含量、可溶性蛋白含量的變化，探討不同遺傳背景的水稻種質資源與稻瘟病的抗性關系，旨在為防治稻瘟病提供依據。

材料與方法

材料

本試驗選用的水稻品種為感病材料日本晴、抗病材料武運粳7號，所接種的稻瘟病病菌菌株為淮安市本地的稻瘟病菌生理小種。挑選顆粒飽滿、大小一致的種子，洗凈后用水浸泡，在26～28 ℃保溫箱中保溫催芽，挑出露白一致的種子播于紗網上，將催芽4～6 d的幼苗（即當苗長至葉心期時）用海綿松松地包裹，嵌入打孔泡沫板（厚度5 cm）中，移至盛有2 L /2 Hoagland營養液塑料箱，在H000GS型智能人工氣候箱中培養。晝夜溫度分別為28、26 ℃，空氣相對濕度為 70%～80%。幼苗適應生長 d后進行噴霧接種處理。

2噴霧接種處理

將上述稻種的水稻幼苗分為日本晴健康株對照、日本晴接菌處理株、武運粳7號健康株對照以及武運粳7號接菌處理株。健康株對照的處理方法是在水稻幼苗葉片上均勻噴霧接種緩沖液，接菌處理株則是在葉片上噴霧接種含淮安市本地稻瘟病菌混合小種的懸浮液，接種后0、、2、3、4、5、6 d天各取樣次，測定水稻幼苗葉片中OD、SOD、CAT等保護酶系活性的變化及MDA含量、可溶性蛋白含量變化，每個樣品設置4個重復。

3生理指標的測定

3SOD活性測定稱取05 g水稻葉片放入研缽中，加5 mL預冷的磷酸緩沖液研磨成勻漿，0 000 r/min離心 20 min，低溫保存上清液，其上清液即為酶的粗提取液，采用NBT還原法測定SOD活性[2-3]。

32OD活性測定取 mL上述酶的粗提取液，以愈創木酚為底物，測定470 nm處的吸光度，酶活性用每克蛋白每分鐘D470 nm增加值表示。

33CAT活性測定采用魏穎穎等的方法，將5 mL濃度為30%的H2O2用005 mol/L磷酸緩沖液（pH值為70）稀釋定容至25 mL，取反應液28 mL，加入上述酶的粗提取液02 mL，以反應液為對照，測定CAT活性[3]。

34MDA含量測定采用硫代巴比妥酸（TBA）法[4]測定葉片的MDA含量。

35可溶性蛋白含量測定稱取05 g水稻葉片放入研缽中，加5 mL蒸餾水研磨成勻漿，0 000 r/min離心20 min，后取上清液 mL用考馬斯亮藍G-250染色法測定可溶性蛋白含量，以牛血清蛋白作為標準。

4數據處理

用SSS 60 軟件統計分析數據。

2結果與分析

2接種稻瘟病菌對水稻幼苗形態的影響

從水稻葉片噴霧接種稻瘟病菌混合小種0 d后發病的表型來看，其稻瘟病發病表型已有明顯顯現。感病材料日本晴接菌處理株的幼苗葉片上邊緣及中央產生了橢圓形或梭形病斑，中間灰白色，外圍為褐色，最外層有黃色暈圈，呈現嚴重的發病表型。抗病材料武運粳7號的幼苗葉片沒有明顯的病斑（圖）。由此可見，不同遺傳背景的水稻種質受稻瘟病菌侵染后抗性表現不同。

22接種稻瘟病菌對水稻幼苗葉片活性氧清除酶系活性的影響

22接種稻瘟病菌的水稻幼苗葉片中SOD活性變化

SOD是植株體內清除超氧陰離子的酶系，負責把過量的超氧陰離子轉化為過氧化氫。噴霧接種本地稻瘟病菌混合小種后，水稻幼苗葉片內SOD的活性隨處理時間的延長而提高（圖2）。日本晴幼苗葉片的SOD活性提高幅度較大，武運粳7號葉片的SOD活性在接種后～5 d內呈上升趨勢，接種后6 d稍有下降。稻瘟病菌侵染后可能引發了日本晴葉片內超氧陰離子含量增加，植株需要增加SOD活性以快速清除過量的超氧陰離子。

222接種稻瘟病菌的水稻幼苗葉片中OD活性變化水

稻幼苗葉片接種稻瘟病菌之后，葉片內OD的活性均顯著（圖3）。其中日本晴葉片接種后6 dOD活性比對照提高約6倍；武運粳7號植株葉片內OD活性變化相對平緩，提高幅度較小。OD是植物細胞用來清除過氧化氫、酚類、胺類等毒害物質的抗氧化酶，該酶活性的提高暗示稻瘟病導致了葉片內上述毒害物質的積累，從而引發了OD活性的增強，以分解毒害物質。

223接種稻瘟病菌的水稻幼苗葉片中CAT活性變化

接種稻瘟病菌混合小種后，日本晴葉片中CAT活性隨處理時間的延長呈上升趨勢，抗病材料武運粳7號葉片的CAT活性隨處理時間的延長呈先上升后下降趨勢（圖4）。CAT活性在稻瘟病病情較重的葉片內活性較高，表明稻瘟病致使葉片的氧化還原平衡被打破，CAT活性增強以緩解植物受到的傷害。

224接種稻瘟病菌的水稻幼苗葉片中MDA含量變化

水稻幼苗葉片未受到稻瘟病菌侵染時，抗病材料與感病材料葉片中MDA含量差別較小，隨著侵染時間的延長，抗病材料與感病材料葉片中MDA含量都呈上升趨勢，且武運粳7號葉片內MDA含量的增加幅度小于日本晴葉片（圖5）。MDA含量增加表明植株葉片在感染稻瘟病過程中發生了膜脂過氧化，日本晴葉片內MDA含量增高表明其受稻瘟病傷害的程度重于武運粳7號。

225接種稻瘟病菌的水稻幼苗葉片中的可溶性蛋白質含量變化

稻瘟病菌侵染水稻后，水稻葉片細胞中的可溶性蛋白質含量出現了明顯變化。感病材料日本晴、抗病材料武運粳7號葉片中可溶性蛋白質含量都呈上升趨勢，且感病材料葉片內可溶性蛋白含量增長幅度大于抗病材料（圖6）。

3結論與討論

本試驗中，稻瘟病菌侵染水稻抗病材料、感病材料幼苗葉片后，葉片內SOD、OD、CAT等活性氧清除酶系活性均增強，且MDA含量、可溶性蛋白含量都呈增加趨勢。感病材料日本晴活性氧清除酶系活性的提高幅度明顯大于抗病材料，這可能是由于稻瘟病菌侵染的刺激，打破了植株體內氧化還原系統的平衡，引起葉片內活性氧含量增加，為了減緩活性氧對植物細胞的破壞，活性氧清除系統的酶類SOD、OD、CAT活性提高以清除活性氧，同時，由于活性氧的積累致使膜脂過氧化，故而膜脂過氧化的最終產物MDA含量增加。在病原物的刺激下，可能會抑制水稻體內蛋白降解酶的活性或激活蛋白合成酶的活性，從而導致水稻葉片細胞內可溶性蛋白質含量增加。抗病能力較強的水稻種質因具有較強的免疫力，對病害抗性較強，受到稻瘟病菌侵染后，體內活性氧的積累量較感病種質相對較低，需要調動的活性氧清除酶系統的增加幅度相對較小。本研究也表明氧化還原系統在水稻抗稻瘟病過程中發揮著重要作用。在病害環境下，細胞內氧化還原平衡體系的維持對植物的抗病性非常重要，SOD、OD、CAT等是植物體內清除活性氧物質的重要酶，它們的活性高低可作為植物抗逆性的指標。SOD是植物體內防御活性氧毒性的重要酶，它能清除超氧化物陰離子自由基，提高植物抗逆性。OD不僅能聚合成木質素防御入侵病原菌，而且和CAT一樣屬于植物體內重要的活性氧清除酶類，其作用是將H2O2降解成為無毒害的H2O、O2[5]。MDA是膜脂過氧化的最終產物，它直接影響膜上結合酶的比例、活性，過量的MDA會對細胞產生毒害作用。可溶性蛋白質不僅是基因表達的直接產物之一，同時也是植物性狀表現的物質基礎。研究表明，甜瓜植株受蔓枯病菌侵染后，抗病材料的SOD、CAT 活性均高于感病材料，且抗病材料的OD活性提高幅度明顯小于感病材料[6]。陳罡等在研究稻瘟病菌粗毒素的致病力及其對水稻幼苗生理生化特性的影響時發現，粗毒素處理后，隨著處理時間的延長，OD活性提高，SOD活性表現為初期上升，一段時間后又有下降的趨勢[7]。郭連安等研究表明，不同稻瘟菌粗毒素濃度處理后，水稻幼苗的OD活性先升高后降低，可溶性蛋白含量顯著下降[8]。陳學平等研究表明，經煙草普通花葉病毒處理后，抗病煙草品種CAT活性低于感病品種[9]。本研究表明，接種本地稻瘟病菌混合小種后，水稻抗病材料、感病材料葉片內的活性氧清除酶系活性、可溶性蛋白質含量基本都呈增加趨勢，并且感病品種的增加幅度明顯高于抗病品種，可能是日本晴作為稻瘟病病情較重的受體，其免疫能力較弱，受致病菌株侵染后，破壞了葉片內氧化還原系統的平衡，活性氧類物質含量增加，對細胞造成了傷害，而其自身免疫系統保護機制的應答調節了活性氧清除酶系，抗氧化物質的活性增強，以減緩其受傷害程度。根據活性氧清除系統的酶系所催化的反應過程，并結合植物體細胞內活性氧的代謝過程，本研究提出了水稻受稻瘟病菌侵染后氧化還原系統狀態變化及活性氧代謝路徑圖，以期更好地理解水稻對稻瘟病的應答機制（圖7）。

[HS2][HT85H]參考文獻：[HT8SS]

[ZK（#]Miah G，Rafii M Y，Ismail M R，et al Blast resistance in rice：a review of conventional breeding to molecular approaches Molecular Biology Reports，203，40（3）：2369-2388

[2]Liu W D，Liu L，Ning Y S，et al Recent progress in understanding AM-and effector-triggered immunity against the rice blast fungus Magnaporthe oryzae Molecular lant，203，6（3）：605-620

[3]Bagnaresi ，Biselli C，Orrù L，et al Comparative transcriptome profiling of the early response to Magnaporthe oryzae in durable resistant vs susceptible rice（Oryza sativa L） genotypes LoS One，202，7（2）：e5609

[4]Rahim H A，Bhuiyan M A，Lim L S，et al Identification of quantitative trait loci for blast resistance in BC2F3 and BC2F5 advanced backcross families of rice Genetics and Molecular Research，202，（3）：3277-328