臨床代謝組學及其應用

王 凱，江 華，陳 偉，彭 謹，曾 俊，2b

(1.川北醫學院，四川 南充 637100；2.四川省醫學科學院·四川省人民醫院 a.急診醫學與災難醫學研究所創傷代謝組多學科實驗室；b.創傷外科，四川 成都 610072；3.北京協和醫院腸外與腸內營養科，北京 100730)

臨床代謝組學及其應用

王 凱1，2a，江 華2a，2b△，陳 偉3，彭 謹2a，曾 俊2a，2b

(1.川北醫學院，四川 南充 637100；2.四川省醫學科學院·四川省人民醫院 a.急診醫學與災難醫學研究所創傷代謝組多學科實驗室；b.創傷外科，四川 成都 610072；3.北京協和醫院腸外與腸內營養科，北京 100730)

臨床代謝組學是系統生物學研究重要的組成部分，定量定性分析機體受到刺激或者疾病擾動前后小分子代謝產物的動態變化，研究機體整體代謝網絡擾動的一門技術。最近幾年，其在疾病研究、藥物毒性分析、臨床營養研究，以及在細胞代謝組學等領域飛速發展，但是對臨床生物樣本的精確定性識別和定量計算仍然需要進一步突破。使用恰當的方式將代謝組學數據數字化，從而建立恰當的測度空間是未來綜合系統代謝組學發展方向。

臨床代謝組學；核磁共振；質譜；綜合系統代謝組學；系統生物學

代謝組技術肇端于20世紀90年代中晚期，該概念的提出，應歸功于英國曼切斯特大學的Steven G.Oliver和倫敦帝國理工學院Nicholson JK，前者于1998年創立了metabolomics這一概念[1，2]，后者被認為于1999年創立了metabonomics的概念。

1 代謝組學發展概況

代謝組學是在多種物理化學和分析化學的技術平臺上發展起來的，這些技術平臺包括：核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)、質譜(mass spectrometry，MS)和多種色譜。通過單獨或聯合應用這些技術手段，研究者能夠對生物體代謝過程中的各種化合物進行全面和定量分析[4～9]。不同于經典、針對單一代謝產物和代謝通路的檢測技術(如同位素示蹤)，代謝組技術可以通過一次采樣，獲得數以百計的體內代謝化合物的定量數據。相較于基因組學、蛋白質學，代謝組學關注的是基因和蛋白質表達的最終作用產物，對患者整體代謝體系進行評估，通過分析體液組成，獲取在疾病過程中具有特異性的代謝產物“生物標志物”，幫助了解病變過程中機體代謝的改變，輔助臨床診斷和治療，其臨床應用價值已經在多個領域得到了證實。

總結起來，與傳統的各種組學(基因組、轉錄組及蛋白組)技術相比，代謝組學的優勢包括[10～12]：代謝產物的檢測更容易；代謝物的種類遠少于基因和蛋白的種類；代謝產物在所有個體內都是類似的，樣品方便易得，可較為容易地實現物種間代謝網絡比較研究；對代謝網絡的研究不僅涵蓋了機體自身代謝過程的動態變化，還隱含了對外界環境(如食物、藥物等)作用于機體的探索；很多復雜疾病(如代謝綜合征、肥胖、心血管疾病、癌癥等) 的發病機制和過程主要反映在代謝物網絡上，且在基因水平上的機制性變化，最終的調控還是要反映在代謝網絡上。

2 代謝組學的兩大主要分析平臺

2.1 NMR NMR分析是源自于物理化學和量子物理學的一項技術。最先發展出來的用于生物樣本的NMR波譜分析技術，是基于1 h核的1 h-NMR，由該技術兼具良好的靈敏度，很好的定性能力、成本低廉、測試快速、樣品制備簡單等多種優勢。與此同時，其他NMR核(如13C、31P、15N)也隨著儀器技術的發展進步而陸續被引入臨床代謝組學研究領域。

NMR技術在臨床研究和應用中獨有的優勢包括：①可以同時提供待測化合物的結構和質量信息；②能以完全無損的方式對組織和體液進行分析測試。這意味著NMR測試過的樣品還可用于其他技術平臺，實現了“一個樣本，同時用于多個研究目的”，重現性強。

更為重要的是，NMR代謝組學技術從其誕生之日起，就以模式識別技術作為其數據分析的基本理論，在現今的大數據時代，其優勢更為突出。代謝物的集合，可以視為一種本體，可以視為超越了物種、基因、細胞、以及組織的獨立分析對象。隨著數學分析工具更進一步的滲透，NMR代謝組學最有可能成為將基礎研究與臨床研究連接在一起的方法學框架，并由之而成為新一代智慧檢驗分析系統的基礎性平臺。

最新開發出的定量核磁絕對濃度應用軟件，不需要內部對照品或者外部電子標準信號，只需用已知濃度樣品做一次校正便可以對不同濃度的未知樣品在不同脈沖角度下采集的數據來確定積分區域，其所呈現的積分數值能反映待測物質的絕對濃度。此外，Liu等[13]發明了一種新的核磁定量處理圖譜時自動積分的方法，大大縮短了測定大批量樣品時數據處理的時間，并提高了分析效率。

2.2 MS MS是另一大類常用的代謝組學檢測平臺。其原理是通過測量離子質荷比的方法，使待測樣品中各組的分子源發生電離，生成不同荷質比的帶電荷的離子，經加速電場的作用，形成離子束，進入質量分析器，在質量分析器中，再利用電場和磁場使發生相反的速度色散，將它們分別聚焦而得到質譜圖，確定待檢物分子量，進而實現對待檢物的定性。

MS技術主要的是一種定性鑒定技術，在單純品有機分子的鑒定方面發揮了極為重要的作用。它能快速準確測定單純品生物分子的分子量，尤其是生物大分子。因此其是蛋白質組學研究中最為重要的工具，已經很好地實現了多種蛋白質從一級結構到高級結構的鑒定。已發表的代謝組學研究中，基于MS平臺技術的和基于NMR平臺技術的，各占半壁江山。但與NMR技術相比，MS技術面臨的最大挑戰是樣本制備程序較為繁瑣、對樣本具有破壞性，已經檢測過的樣本、無法再用于其他技術平臺分析，對生物樣品的重現性劣于NMR、對混合物的分析測試能力較弱、且只能作為定性工具，若要實現定量，必須與氣相色譜(GC)或液相色譜(LC)聯用，更增加應用的繁瑣性。這樣就限制了其在臨床研究條件下的普及應用。

2.3 NMR數據預處理、代謝物波譜分析及模式識別 NMR原始數據是時間域上的音頻信號，這些元數據不能用于模式識別分析，需要處理后方可做進一步分析。預處理的方法首先是對所有的譜圖進行相位調節與基線校正，然后對數據矩陣進行歸一化和標準化處理。通常，氫原子空間分布復雜的化合物有可能對應多個波峰，因此需利用數據挖掘技術建立起波譜和物質之間的恰當的對應關系，此即“峰匹配”。等距離桶狀積分是代謝組學的研究中對NMR波譜進行峰匹配的最常見技術，其主要的目的是降低連續的波譜信號維數，并且同時減少化學位移漂移的影響。

一張一維1 h-NMR譜圖就可能含有幾千條譜線，從中抽提對于研究或臨床診斷有價值的信息是任何代謝組實驗的關鍵問題。代謝譜的差異，事實上體現為波譜線的差異。進而言之，這些變異有的是來自于機體代謝本底的不同，有的則是由疾病造成的。由于這幾千條譜線的差異不可能都與研究者關注的疾病相關，因此，如何抽提出對于樣本整體變異貢獻最大的一系列譜線就是代謝組研究的重點。這一信號識別的過程，首先要利用數據降維的方法來實現。數據降維的核心原理是將n維空間的圖景在2維或3維空間顯示出來，并盡可能避免原n維空間中分類信息的丟失。數據降維，首先是對數據進行無監督的模式分析，然后選定某一類樣本進行數據建模，再對變量進行加權處理，選定主成分建模的主成分數目，最后利用有有監督統計方法判別未知樣本。

3 臨床代謝組學研究的最新應用

3.1 疾病研究 代謝組學廣泛應用于與疾病早期診斷相關的代謝標記物，通過對代謝物波譜的分析從而對疾病進行早期診斷及治療。英國帝國理工學院的Nicholson等利用快速蒸發電離質譜技術，對外科手術中電刀切割時釋放的氣霧(“煙”)進行分析?？蓹z測出正常組織、原發性腫瘤和轉移性腫瘤組織的脂類代謝差別。此技術與外科電刀聯接后，就被開發成為一種可用于術中組織快速診斷的工具，被稱為智能刀(intelligent knife，iKnife)。Nicholson等對302個患者的各種組織樣品在實驗室進行分析，建立起1624種癌組織和1309種非癌組織數據庫?？蔀橥饪漆t師精準切除腫瘤組織提供了有力的支持[14]。四川省醫學科學院·四川省人民醫院創傷代謝組多學科實驗室則建立了基于1 h-NMR技術的脊髓創傷后隨時間變化的大鼠血漿代謝指紋圖譜的方法[15，16]。使用該方法，可利用代謝輪廓對損傷后不同時間點的機體狀況進行區分，并且篩選出可用于作為標定脊髓損傷后傷情隨時間演化的代謝標記物。建立的回歸方程可以實現對傷情精準評價和預后預測。此外，近年來還有不少基于代謝組學技術建立的對臨床重要疾病的研究，例如中國科學院大連物理化學所許國旺課題組基于正相液相色譜/電噴霧線性離子阱質譜法，建立了可用于識別2型糖尿病的體液代謝指紋圖譜，并篩選出4種可用作為生物標記物的磷脂分子[17]。同時，該課題組基于固相萃取-高效液相色譜(SPE-HPLC)，建立了腫瘤患者的尿液中核苷酸代謝輪廓分析方法，用于建立腫瘤患者與健康對照組尿液中核苷的水平和排放模式[18]。其檢測惡性腫瘤的敏感性高于臨床應用的腫瘤標記物。在肝癌與肝硬化患者研究中應用基于液相色譜-質譜(LC-MS)聯用的方法，可以在健康人群中將肝癌及肝硬化患者進行有效的區分，且肝癌診斷中肝硬化及肝炎患者的假陽性率降低為7.4%[19]。

3.2 藥物毒性分析 最早開始對藥物毒性分析的是Nicholson實驗室，他們利用基于NMR的代謝學和模式識別技術對藥物毒性進行評價分析[20，21]。利用動物體液及組織的NMR圖譜對百余種典型藥物的毒性進行了研究。可以判斷出毒性影響動物的組織器官和位點，推測出藥物的作用機制，并確定毒性相關的標記物，建立毒物影響動物內源性代謝產物隨時間變化的軌跡及可供毒性預測的專家系統。代謝組學技術在藥理學的重要應用還體現在對中藥中的單體成分毒性評價：如探索常見重要毒性成分馬兜鈴酸腎損害的機制，主要是經由抑制三羧酸循環造成的[22]。王清秀等對經大黃素處理的大鼠尿液、血漿和腎臟組織進行研究，證明尿液中葡萄糖及氨基酸水平升高，其可作為腎小管損傷的標記物[23]。而Mally等利用1 h-NMR代謝組學技術對腎功能損傷的標記物進行了研究，在FeNTA和溴化鉀引起小鼠腎功能損傷的兩種模型中，證明了4-羥基-2(E)-壬醛基-巰基尿酸(HNE-MA)作為腎功能損傷標記物的可行性[24]。

3.3 臨床營養研究 眾所周知，臨床營養是20世紀后半葉興起的多學科交叉專業，其研究的核心關鍵問題即是營養素-代謝網絡的相互作用，是代謝組學技術具有比較優勢的學科之一。目前代謝組學在臨床營養研究中的應用主要有三個方面：①營養素和膳食干預研究；②膳食標志物的研究；③飲食相關疾病的研究[25]。營養素和膳食干預研究主要是確立干預的作用機理以及怎樣影響代謝途徑。例如，關于黑巧克力對機體代謝物影響的研究表明，進食黑巧克力后可以減少壓力相關的代謝產物(甘氨酸、脯氨酸、β丙氨酸和檸檬酸鹽等)[26]。一項33名絕經期后婦女進食全麥黑麥面包或精制小麥面包的NMR研究顯示，進食全麥黑麥面包的人群血樣中支鏈氨基酸減少(亮氨酸和異亮氨酸)，而NN-二甲基甘氨酸升高[27]。最近關于嬰兒喂養方法的一項研究證明了NMR代謝組學在揭示膳食成分有益作用的分子機制中的強大作用[28]。通過分析母乳和標準喂養嬰兒的尿液NMR波譜，研究者們發現一系列蛋白質和脂類代謝相關的代謝產物在標準喂養的嬰兒尿液中有增高。飲食標記物在改進飲食評估方法上的作用已經被廣泛認可，并且被臨床營養學界認為是代謝組學在本領域最具潛力的應用方向之一[29]。基于NMR代謝組學的研究已可鑒定出人類在進食肉類后具有特征性的代謝相關標記物，包括肌酐、肌酸、肉堿、肌肽、牛磺酸、1-甲基組氨、3-甲基組氨及氧化三甲胺(Trimethylamine oxide，TMAO)等。其中，TMAO在其他研究中也被證實與肉類代謝相關，表明TMAO可以作為飲食中蛋白質的標記物。最近的一項基于NMR波譜評估高蛋白與低蛋白飲食代謝的研究證實尿樣中TMAO與尿氮排泄呈高度相關性[30]。最近的研究還發現，支鏈氨基酸與胰島素抵抗和2型糖尿病之間存在相關性[31]。在一項1680例患者的研究中，NMR定量分析支鏈氨基酸顯示出其循環水平可預測胰島素抵抗風險[32]。

3.4 細胞代謝組學 目前，多種代謝組學技術已經用于建立造血細胞的生理狀態和人類造血系統疾病下的代謝圖譜。年輕和衰老的普通紅細胞的代謝分析可以顯示代謝產物的水平與鐮狀紅細胞病直接相關[33]。高解析NMR波譜被用于鑒別人結直腸腺癌細胞(Caco-2)細胞的分化程度，結果顯示分化的細胞中代謝產物存在明顯差異[34]。大多數代謝產物存在于早期未分化細胞和晚期分化細胞中，某些特定的代謝產物顯著的變化，特別是肌醇和牛磺酸。然而，建立細胞代謝的綜合表征是一項非常艱巨的任務，因為內源性代謝物在物理和化學性質上的巨大差異。目前，大量代謝物的化學性質仍然不明確，加上標準的萃取及分離方法還存在問題。標準化合物不易獲得、數據庫尚未完善及代謝途徑還未理清，這些問題導致映射和解釋相應的標記物存在相當大的困難。

4 從代謝型到復雜代謝網絡分析

Modi等利用網絡生物學演繹了大腸桿菌中sRNAs的相互調節網絡，顯示出復雜網絡分析能夠識別sRNAs的生物功能[35]。Chen等利用腫瘤細胞構建起凋亡的蛋白-蛋白相互作用網絡，分析并證明了3個潛在的藥物靶點[36]。這些研究表明針對代謝復雜網絡進行數據挖掘可以找到有生物功能的藥物靶點。其原理為，基因、蛋白質、小分子代謝物之間通過相互結合、解離和相互催化形成了一套異常復雜的網絡。本課題組確定嚴重的脊髓損傷的代謝物后，在整體代謝網絡上查找代謝作用和相互作用，從而開發出的三步法，簡述如下[16]：①利用人類代謝組數據庫(the human metabolome database，HMDB)的代謝通路功能，檢索催化特定代謝物的酶類；②在京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)數據庫中反查出相應的酶類所在的代謝途徑；③使用Matlab的KEGG API工具包繪制受損傷影響的代謝網絡擾動圖。最終基于1 h-NMR譜構建出一個以代謝為基礎的，具有臨床應用前景的脊髓損傷的嚴重程度定量評價模型，建立了一套集成了代謝組學分析與代謝網絡分析的新方法。從本體代謝提取顯著改變的代謝物并映射到一個代謝網絡。產生這些代謝物的酶也被確定，并包括在網絡中。在損傷后受到干擾的主要代謝路徑包括：①視黃醛(維生素A)和視黃酸(RA)代謝；②甘油磷脂和花生四烯酸(AA)代謝；③NAD-NADPH轉化過程；④酪氨酸代謝；⑤尸胺和腐胺代謝；⑥醚和醇的代謝紊亂。

5 NMR代謝組學面臨的挑戰與解決方法

基于NMR的代謝組學蓬勃發展的同時，也面臨著巨大挑戰。此即對臨床生物樣本的精確定性識別和定量計算。臨床代謝組研究使用的標本，是血漿、尿液等生物體液，其每一份標本，都是一個由上百種單體化合物構成的復雜體系。對一位波譜學家而言，面對混合物，他通常會先對其進行單分子分離純化，再進行NMR掃描鑒定結構，通常不會一次性對混合體系進行掃描[9～13]。然而，臨床代謝組研究的要求迥異于此：我們面臨的標本，不僅種類繁多，需要逐個進行分離純化，成本巨大，且費時費力。

面對上述挑戰，有些研究者已經開展了探索。一種思路是提高設備探測精度和聯用多種平臺。例如，2015年Miao等[37]利用HPLC和微探頭NMR聯用技術分析復雜生物體液及組織。在小鼠尿液和排泄物中分別鑒定出83種和73種代謝產物，其中各有40種和45種代謝產物是在常規NMR技術下無法分離出來的。但即使如此，對代謝譜中許多可見峰無法鑒定。因此，解決臨床體液標本的NMR波譜精準鑒定，是下一代代謝組學技術發展的核心關鍵問題。近年來，從儀器設計進路提出了一種可能的解決方案，此即不斷提高NMR的場強，目前已問世的頂級NMR波譜儀，其場強已經高達1.1 GHz。然而，這類儀器價格極為昂貴，且與之相配合的物質解析算法尚不成熟，不適合推廣應用。破解這一難題，需要另辟蹊徑。

基于上述認識我們提出了一種全新的解決問題的思路：引入計算數學工具實現工程解。欲要使用代謝型來描述疾病過程，先決條件是一定要建立合適的度量空間，從而才能在此空間中建立動力系統。進而將疾病的演變問題轉化為一類軌道的描述問題[38]。進而可使用計算數學的理論和技術建立新一代代謝組學數據分析理論與技術工具。最終將代謝組學技術與其他多種組學技術的發現結合在一起，形成一種系統性的疾病發生發展機制研究范式。

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Clinical metabolomics and its application

WANG Kai1，2a，JIANG Hua2a，2b，CHEN Wei3，PENG Jin2a，ZENG Jun2a，2b

衛生部急診醫學國家臨床重點專科建設項目、四川省科技廳科技支撐計劃項目(編號：SZ20120209，2011SZ0336，2015SZ0110)及成都市科技局人口與健康項目(編號：12PPYB181SF-002，11PPYB009SF-289)

R0657.61；R-33；R34；R446

B

1672-6170(2015)06-0160-05

2015-06-21；

2015-09-11)

△通訊作者