攜帶psm-mec基因耐甲氧西林表皮葡萄球菌的耐藥譜研究

楊永長，肖代雯，喻 華，姜 偉，陳 亮，胡洪華，周 薇，黃文芳(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 成都 610072)

攜帶psm-mec基因耐甲氧西林表皮葡萄球菌的耐藥譜研究

楊永長，肖代雯，喻 華，姜 偉，陳 亮，胡洪華，周 薇，黃文芳
(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 成都 610072)

目的 比較攜帶與未攜帶psm-mec基因耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)的耐藥譜，為治療MRSE引起的感染提供理論依據(jù)。方法 收集臨床分離并經(jīng)過全自動微生物奠定系統(tǒng)準(zhǔn)確鑒定的表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis，S.epidermidis)165株，通過PCR擴(kuò)增esp和mecA基因，準(zhǔn)確鑒定和區(qū)分甲氧西林敏感表皮葡萄球菌(MSSE)和MRSE。擴(kuò)增psm-mec，fudoh和p221片段確認(rèn)攜帶psm-mec基因的MRSE菌株，比較分析攜帶與未攜帶psm-mec 基因MRSE的耐藥譜。結(jié)果 83.64%的臨床分離S.epidermidis為MRSE，其中29株攜帶psm-mec基因，攜帶率為17.58%，且僅分布于MRSE中。臨床分離MRSE易對苯唑西林、青霉素、紅霉素、復(fù)方新諾明和克林霉素耐藥，未發(fā)現(xiàn)對利奈唑胺、呋喃妥因、普丁/達(dá)福、萬古霉素和替加環(huán)素耐藥菌株。攜帶psm-mec基因MRSE對環(huán)丙沙星、慶大霉素、利福平和復(fù)方新諾明的耐藥率明顯高于未攜帶psm-mec基因MRSE。結(jié)論 攜帶psm-mec基因MRSE易對苯唑西林、青霉素、紅霉素、克林霉素、環(huán)丙沙星、慶大霉素、利福平和復(fù)方新諾明耐藥。

耐甲氧西林表皮葡萄球菌；psm-mec；耐藥譜

表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis，S.epidermidis)是人體皮膚正常菌，可引起慢性感染和導(dǎo)管相關(guān)性感染，難以治愈，已引起醫(yī)學(xué)界廣泛關(guān)注[1～6]。甲氧西林耐藥是院內(nèi)感染S.epidermidis的主要特征之一，從全球范圍來看，臨床分離耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)占75%～90%[7]。國外研究發(fā)現(xiàn)，引起院內(nèi)感染的S.epidermidis常對氨基糖苷類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素、四環(huán)素、氯霉素和克林霉素耐藥，但對新出現(xiàn)的抗生素均敏感[2]。雖然出現(xiàn)了萬古霉素中介菌株，但高水平萬古霉素耐藥菌株的傳播尚未見報(bào)道[8]。近年來，研究者發(fā)現(xiàn)SCCmec III型和IV型與抗生素耐藥譜之間存在一定關(guān)系[9]。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)研究提示，攜帶psm-mec基因MRSE的SCCmec型別主要為以II型和/或III型為主要結(jié)構(gòu)的混合型。我們猜想，攜帶psm-mec基因的MRSE可能表現(xiàn)出特有的抗生素敏感性。因此，本研究收集臨床分離S.epidermidis，采用分子生物學(xué)方法區(qū)分和鑒定攜帶psm-mec基因MRSE，通過藥敏結(jié)果分析攜帶psm-mec基因MRSE的耐藥譜，為臨床治療MRSE引起的感染提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 菌株來源 2012年3月至2014年3月四川省人民醫(yī)院住院患者分離的165株S.epidermidis，所有菌株采用全自動微生物鑒定系統(tǒng)鑒定，其中血液分離128株，痰液分離15株，中段尿液分離5株，傷口分泌物分離7株。

1.2 試劑和儀器 細(xì)菌DNA提取試劑(廣州達(dá)安)；2×Taq Master Mix(北京康為世紀(jì))；100 bp DNA Ladder (北京天根)；血平板(鄭州安圖生物)；瓊脂糖(Biowest)，Tris堿(Novon)；PCR擴(kuò)增儀PTC-200、凝膠成像儀(Bio-Rad)；生物安全柜、細(xì)胞培養(yǎng)箱(Heal Force)；電泳儀(Sanvant)；紫外分光光度計(jì)、高速低溫離心機(jī)(Eppendorf)；esp、mecA、psm-mec、fudoh和p221片段擴(kuò)增的引物由上海Invitrogen公司合成。

1.3 細(xì)菌培養(yǎng)與基因組DNA提取 接種單個菌落至3 ml LB液體培養(yǎng)基，37 ℃ 220rpm培養(yǎng)過夜。取1 ml菌液，離心收集細(xì)菌，棄上清。沉淀加入100 μl DNA提取液，100 ℃ 10 min，10000 rpm離心5 min，上清即為S.epidermidisDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR擴(kuò)增esp和mecA區(qū)分MRSE和MSSE

采用PCR擴(kuò)增esp和mecA進(jìn)一步區(qū)分MRSE和MSSE。esp基因的引物序列為esp F：5'-CCAGGGTAACCAGTAACAGT-3'，esp R：5'-GAGCTAAGGGTAA TCCAAGA-3'，PCR產(chǎn)物長度為244 bp；反應(yīng)體系：2×Taq Master Mix 10 μl，10 μM上下游引物各1 μl，模板DNA 2 μl，ddH2O 6 μl。反應(yīng)條件：93 ℃預(yù)變性2 min，93 ℃變性30 s，42 ℃退火30s，72 ℃延伸30 s，進(jìn)行30個循環(huán)，最后72 ℃延伸2mim。mecA基因的引物序列為mecAF：5'-GGGATCATAGCGTCATTA TTC-3'，mecAR：5'-AACGATTGTGACACGATAGCC-3'，PCR產(chǎn)物長度為527bp。反應(yīng)體系：2×Taq Master Mix 10 μl，10 μM上下游引物各1 μl，模板DNA 2 μl，ddH2O 6 μl。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，44 ℃退火30 s，72 ℃延伸30s，進(jìn)行30個循環(huán)；最后72 ℃延伸3 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后Bio-Rad凝膠成像儀檢測。

1.5 擴(kuò)增psm-mec，fudoh和p221基因片段 MRSE psm-mec引物序列為：psm-mec F 5′-CGAAAGCCTGAA TGCAAGTCT-3′，psm-mec R5′-GGATTTCACTGGTGTTATTACAAGC-3′，產(chǎn)物大小為130 bp。反應(yīng)體系：2×Taq Master Mix 5 μl，上下游引物各0.25 μl，DNA 1.5 μl，ddH2O 3 μl。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，42 ℃退火30 s，72 ℃延伸30s，進(jìn)行30個循環(huán)，最后72 ℃延伸5mim。fudoh基因位于SCCmec上，序列包含psm-mec全長及其上下游區(qū)域，fudoh基因擴(kuò)增引物序列F：5′-CAATTCACTTGTCTTAA ACTTTGTAGAAAA AGAAG-3，R：5′-TATTTTATTTTCCATAATTGCCTACCC CATAAG-3′，產(chǎn)物大小為530bp。反應(yīng)體系：2×Taq Master Mix 10 μl，上下游引物各1 μl，DNA 2 μl，ddH2O 6 μl。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后Bio-Rad凝膠成像儀檢測。

1.6 抗生素敏感試驗(yàn) 采用BioMerieux藥敏分析系統(tǒng)進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，比較攜帶與未攜帶psm-mec MRSE耐藥譜的差異。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)數(shù)資料比較采用卡方檢驗(yàn)。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床分離細(xì)菌 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示，165株臨床分離細(xì)菌均可擴(kuò)增出esp基因片段，說明這些菌株均為S.epidermidis，與臨床微生物學(xué)鑒定相符。mecA陽性138株，mecA陰性27株。提示MRSE占臨床分離S.epidermidis的83.64%。其中血液、痰液、尿液和傷口分泌物分離MRSE分別占65.45%、6.06%、3.03%和3.03%，提示不同來源分離的S.epidermidis均以MRSE為主(圖1)。

圖1 不同標(biāo)本來源MRSE和MSSE分布情況

2.2 攜帶psm-mec基因MRSE的篩選和驗(yàn)證 PCR擴(kuò)增psm-mec、fudoh基因和p221片段的凝膠電泳結(jié)果如圖2所示，165株臨床分離S.epidermidis中有29株均可擴(kuò)增出psm-mec、fudoh基因和p221片段，攜帶率為17.58%。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，所有psm-mec陽性標(biāo)本均存在MRSE中，而27株MSSE未擴(kuò)增出psm-mec，提示psm-mec基因僅存在MRSE中。

圖2 psm-mec fudoh、p221 PCR擴(kuò)增凝膠電泳結(jié)果 1：MSSE菌株；2：攜帶psm-mec 的MRSE菌株；3：攜帶psm-mec 的MRSE菌株；4：100bp DNA Ladder；5：fudoh 陽性菌株；6：p221 陽性菌株；7：psm-mec 陽性菌株

2.3 MRSE的耐藥譜 藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，59株MRSE中，未發(fā)現(xiàn)對利奈唑胺、呋喃妥因、普丁/達(dá)福、萬古霉素、替加環(huán)素耐藥菌株，苯唑西林(100%)、青霉素(100%)、紅霉素(89.83%)、復(fù)方新諾明(72.88%)與克林霉素(71.19%)最易耐藥，而對環(huán)丙沙星、慶大霉素、左氧氟沙星、莫西沙星、四環(huán)素的耐藥率分別為45.76%、35.60%、11.86%、5.08%、27.12%和22.03%。同時(shí)發(fā)現(xiàn)15.25%環(huán)丙沙星和54.24%左氧氟沙星中介菌株(圖3)。

2.4 攜帶psm-mec基因MRSE的耐藥譜 29株攜帶psm-mec基因MRSE對環(huán)丙沙星、慶大霉素、利福平和復(fù)方新諾明的耐藥率分別為68.97%、58.62%、51.72%和86.21%。30株未攜帶psm-mec 基因MRSE對環(huán)丙沙星、慶大霉素、利福平和復(fù)方新諾明的耐藥率分別為23.33%、13.33%、3.33%和60.00%(表1)。攜帶psm-mec基因MRSE對環(huán)丙沙星、慶大霉素、利福平以及復(fù)方新諾明的耐藥性明顯高于未攜帶psm-mec 基因MRSE。

圖3 不同菌株藥物敏感性結(jié)果

表1 攜帶與未攜帶psm-mec 基因MRSE的耐藥譜分析

3 討論

定植人體皮膚表面的S.epidermidis是一種重要的院內(nèi)感染條件致病菌，免疫抑制患者中大部分慢性感染和導(dǎo)管相關(guān)感染均由S.epidermidis引起[1]。在美國，22% ICU患者的血流感染和13%人造瓣膜心內(nèi)膜炎歸咎于S.epidermidis。據(jù)估計(jì)，每年用于治療S.epidermidis感染的費(fèi)用大約需要20億美元[2]。我國一項(xiàng)涉及15個城市、17家醫(yī)院的調(diào)查顯示，80%以上臨床分離S.epidermidis為MRSE[3]。近年來，MRSE的檢出率越來越高，已成為全球院內(nèi)感染的重要病原菌[4，5]。

甲氧西林耐藥由可移動遺傳元件SCCmec介導(dǎo)，2009年Queck等[12]在院內(nèi)感染甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌(MRSA)中發(fā)現(xiàn)一種新基因psm-mec，同時(shí)攜帶該基因的菌株主要為SCCmec II型與III型。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該基因也存在院內(nèi)感染MRSE中，且主要以SCCmecII和/或III型結(jié)構(gòu)為主。研究發(fā)現(xiàn)，某些型別的SCCmec具有獨(dú)特的抗生素耐藥譜[11]。我們推測攜帶psm-mec基因的MRSE在抗生素敏感性上具有一定的特征。

本研究通過PCR擴(kuò)增psm-mec、fudoh基因和p221片段證實(shí)165株臨床分離S.epidermidis中，攜帶psm-mec基因的菌株為29株，在MRSE中占21%。為了探討攜帶psm-mec基因MRSE的耐藥譜，本文首先分析了臨床分離MRSE的耐藥情況，結(jié)果顯示，除利奈唑胺、萬古霉素和替加環(huán)素等敏感外，其它抗生素均有不同程度耐藥，與國內(nèi)研究結(jié)果一致[13～15]。接下來比較了攜帶和未攜帶psm-mec基因MRSE在抗生素敏感性上的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，攜帶psm-mec基因MRSE易對環(huán)丙沙星、慶大霉素、利福平和復(fù)方新諾明耐藥。但其具體的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，臨床分離攜帶psm-mec基因的MRSE在抗生素敏感性上具有明顯特征，易對苯唑西林、青霉素、紅霉素、克林霉素、環(huán)丙沙星、慶大霉素、利福平和復(fù)方新諾明耐藥，本研究為治療MRSE引起的感染提供了理論依據(jù)。

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R446.5

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1672-6170(2015)06-0031-04

2015-09-07；

2015-09-10)