腫瘤壞死因子受體相關因子在內毒素耐受中的作用及其相關機制

柯 敏 綜述，李運璧 審校

(1.四川醫科大學，四川 瀘州 646000；2.四川省醫學科學院· 四川省人民醫院兒科，四川 成都 610072)

腫瘤壞死因子受體相關因子在內毒素耐受中的作用及其相關機制

柯 敏1綜述，李運璧2△審校

(1.四川醫科大學，四川 瀘州 646000；2.四川省醫學科學院· 四川省人民醫院兒科，四川 成都 610072)

目前在哺前乳動物中已經發現7個腫瘤壞死因子受體相關因子(TNF receptor associated factors，TRAFs) 家族成員，它們是腫瘤壞死因子受體和 TOLL樣受體信號通路中重要的組成部分。單獨激活或者聯合其他蛋白激活后，TRAFs參與一些細胞因子的產生和釋放及細胞存活，控制著許多生理過程。而腫瘤壞死因子受體相關因子3(TRAF3)是TRAFs家族中功能最為多樣化的成員之一，它能夠正性調節I型干擾素的產生，負性調節絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和非經典NF-κB信號的激活，通過這些途徑，參與炎癥反應過程，也可能參與了內毒素耐受形成的過程。本文就TRAF3在內毒素耐受中的作用及其相關機制的研究進展作一綜述。

腫瘤壞死因子受體相關因子3；蛋白激酶；內毒素耐受

腫瘤壞死因子受體相關因子(tumour necrosis receptor associated factors，TRAFs)是一類胞內接頭蛋白，其在TNFR家族、TLR家族、IL-1R家族以及RLR家族介導的細胞信號轉導中發揮關鍵作用[1，2]。目前已在哺乳動物體內鑒定出7種TRAF分子，它們分別是TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF4、TRAF5、TRAF6、TRAF7，這類分子也存在于其他的多細胞生物體內，例如果蠅等。TRAF3是TRAFs家族成員之一，它主要表達在巨噬細胞、B 細胞以及激活的T細胞胞漿[3]。TRAF3主要通過Toll樣受體和IFN-γ信號轉導途徑來實現其生物學效應，可能在膿毒癥以及相關炎癥性疾病的發生、發展及轉歸中有重要作用。

1 TRAFs家族概述

早在1994年，研究人員通過酵母雙雜交方法發現兩種新蛋白，被命名為腫瘤壞死因子受體相關因子1，2(TNF receptor associated factor 1/2；TRAF1/2)，TRAF1和TRAF2是最先被發現的TRAFs家族蛋白。密歇根醫學院研究人員于1994年12月采用類似的實驗方法，得到了1個含有鋅指結構和TRAFdomain新蛋白，該蛋白能夠與CD40發生相互作用，輔助下游信號通路轉導，因此將這個蛋白命名為TRAF3。TRAF4的發現是通過在乳腺癌組織中提取cDNA后，采用反轉錄方法獲得其序列。TRAF5與TRAF6的發現過程與TRAF3類似，它們都參與到CD40以及LTβR信號通路中參與信號轉導過程[4]。除TRAF7以外，TRAFs家族蛋白都含有一些類似的結構，在氨基酸多肽的C端，都包括1個共同的結構域TRAF-C端，也叫做TRAF結構域，該結構域在TRAFs家族不同成員之間有著保守的氨基酸位點，并且在TRAFs家族蛋白形成同源多聚體以及TRAF蛋白與受體蛋白之間相互結合中起作用[5]。在氨基酸多肽的N端，都含有指環結構和鋅指基序，該結構負責激活下游信號通路及催化底物泛素化。

2 TRAF3概述

2.1 TRAF3的結構 TRAF3是TRAFs家族成員之一，哺乳動物的TRAF3蛋白由568個氨基酸組成，具有TRAFs家族蛋白都類似的結構，氨基酸多肽C端的TRAF結構域及氨基酸多肽N端的指環結構和鋅指基序。TRAF-N控制TRAF蛋白的同源性，TRAF-C端控制TRAF蛋白寡聚化以及促進與上游調節因子的反應。上游調節因子可以是細胞內受體的結構域，比如TNFR2、CD40以及BAFFR；或者是中間受體蛋白，比如TNFR1相關死亡結構域蛋白(TRADD)以及IRAK家族成員。TRAF-N和TRAF-C同樣可以與下游效應分子相互作用，包括cIAP以及NF-κB誘導激酶(NF-κB-inducing kinase，NIK)，下游信號分子可以與TRAF2的TRAF-N結構域結合或者與TRAF3的TRAF-C結構域結合。TRAF3通過結構域與不同的信號分子結合產生不同的生物學效應[6～8]。

2.2 TRAF3的生物學功能

2.2.1 在TLR介導的I型干擾素反應中的作用 目前已有很多研究表明，TRAF3在先天免疫和獲得性免疫中起著重要而獨特的作用。通過研究表明，缺失TRAF3的細胞系在接受不同TLR配體刺激的條件下都不能夠產生Ⅰ型干擾素，并且證明TRAF3能夠與細胞內TLR配體蛋白TRIF和IRAK1 發生相互作用，同時也能夠與下游的TBK-1和IKKε發生相互作用，從而激活Ⅰ型干擾素的表達[9，10]。Karin等[11]報道，TLR4收到外界刺激后，會激發下游一系列泛素化的反應，主要包括TRAF3介導的K48 /K63的泛素化和cIAP1/2介導的蛋白酶體降解途徑。在有cIAP1/2參與的蛋白酶體信號通路中，TRAF3發生K48泛素化降解過程，該過程對于炎性因子產生有重要作用；而在沒有cIAP1/2參與的內涵體TRIF通路中，TRAF3進行著K63自泛素化過程，該過程對于IRF-3 的激活及干擾素的產生都有影響[12]。

2.2.2 在非經典NF-κB信號通路中的作用 NF-κB是一種誘導性轉錄因子，廣泛存在于各種細胞，在細胞受到各種刺激時可被激活，調節大量靶基因，因此在很多重要細胞進程，如細胞生長、分化、凋亡和癌變中均發揮重要作用。目前，在哺乳動物中發現NF-κB家族有5個成員，分別為：NF-κB1(p105/p50)、NF-κB2(p100/ p52)、RelA、RelB和c-Rel。NF-κB信號通路又分為經典NF-κB通路(NF-κB1/RelA / cRel)和非經典NF-κB信號通路(NF-κB2/RelB)。通常情況下，無活性的Rel二聚體存在于細胞質中，它們能夠與NF-κB抑制蛋白(IκBs)相互作用，抑制NF-κB信號通路的激活[11]。在細胞受到外界刺激后，細胞能夠通過一系列激酶磷酸化IκB，促進其蛋白酶體降解，從而使得NF-κB能夠順利進入細胞核，調控基因表達。

TRAF3在非經典NF-κB途徑中的作用的發現，是一個循序漸進的過程。1996年Xu等對小鼠TRAF3基因進行敲除后發現TRAF3-/-小鼠雖然出生時候正常，但是隨著時間的推移，逐漸表現出低血糖癥和外周血白細胞缺少，基因缺失的小鼠在第10 d就會死亡，TRAF3-/-小鼠T細胞介導的免疫反應也是缺失的。這說明TRAF3在小鼠的免疫反應中有著重要作用。后來又有研究者觀察到NF-κB誘導激酶(NF-κB inducing kinase，NIK)能夠與TRAF3蛋白相互作用，在沒有被刺激的細胞中NIK與TRAF3是緊緊的黏附在一起的，這種黏附在一起的相互作用可以觸發NIK的蛋白酶體降解途徑，而NIK是非經典NF-κB途徑所必須的激活因子。因此，TRAF3基因的敲除能夠促進NIK在細胞中的積累，引起IKKα的激活和p100的加工，并使IKKα發生二聚化，從而激活非經典NF-κB信號通路[13]。隨后有實驗通過敲除NF-κB2-p100基因和TRAF3基因，小鼠能夠存活[14]，也證明了這一點。說明NF-κB2-p100基因缺失能夠對發生膿毒癥的TRAF3-/-小鼠產生保護作用。

2.2.3 負性調控MYD88依賴的MAPK的激活 Toll樣受體4(TLR4)信號通路的活化，導致MYD88的激活，形成由TRAF3、TRAF6、cIAP、UBC13、IKKγ及TAK1組成的多蛋白復合體[15-16]。TLR4信號通路的激活伴隨著TRAF3的降解，而這個過程依賴于cIAP介導的TRAF3蛋白K48多聚泛素化，進而使TAK1得以釋放，從而使MAPK信號激活。因此，通過RNA干擾抑制cIAP的功能后可以阻礙TRAF3的降解，同時阻斷TAK1釋放到胞漿，最終導致TAK1介導的JNK活化水平降低，促炎因子TNF-a、IL-6和IL-12的產生減少。

由此可見，TARF3控制著TLR4下游兩條獨立的信號通路，即TRAF3正性調節 I IFN反應—需要TRAF3蛋白K63泛素化；負性調節MYD88蛋白依賴的JNK和p38 的激活—依賴于cIAP介導的TRAF3蛋白K48多聚泛素化降解以及TAK1的活化[17，18]。

3 TRAF3與內毒素耐受的關系

內毒素耐受是指動物或體外培養的單核/巨噬細胞等在給予小劑量的內毒素預處理后，對LPS再次刺激時無反應或反應性明顯降低，表現為炎癥因子分泌減少，機體炎癥損傷明顯減輕，動物在致死劑量內毒素再次刺激后的存活率提高。根據預處理劑量、處理次數、時間間隔等的不同，可將內毒素耐受分為2個階段：早期耐受和晚期耐受。早期耐受出現早，非抗體介導，短暫而可逆，為內毒素刺激后細胞激活狀態的改變，表現為單核巨噬細胞系統尤其是肝臟巨噬細胞內生性致熱原生成大幅度減少；晚期耐受出現晚，乃針對O抗原及核心抗原的抗內毒素抗體介導的巨噬細胞釋放內生性致熱原能力減弱。一般所指的內毒素耐受為早期耐受。目前認為，內毒素耐受是生物在長期進化過程中形成的一種保守的保護性調節機制，是一種適應性應答，避免了機體對內毒素刺激的持續過度反應，是機體防御機制的重要組成部分。

近年來，有關LPS耐受的分子機制已有較多報道。目前認為，單核巨噬細胞系統是內毒素作用的主要靶細胞，是產生內毒素耐受的主要效應細胞，也是內毒素耐受發生的中心環節。從內毒素預處理到內毒素耐受的產生，這個過程包括：內毒素與MPS受體結合，結合后信號轉導入胞內，胞內信號轉導入胞核，胞核內基因表達，細胞因子等效應分子表達。這個過程中的多種細胞因子參與內毒素耐受的形成，其中包括正性因子的下調，如MYD88、S100A8等。負性因子的上調，如Tollip、IRAK-M、SOCS1等[19]。

最近研究發現，TRAF3能夠負性調控絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路的激活、正性調節β干擾素TIR結構域銜接蛋白(TRIF)信號途徑的活化，可能參與了LPS耐受的誘導。李培志[20]等對肝臟Kupffer細胞內毒素耐受進行研究，發現內毒素耐受時Kupffer細胞內K-48泛素化水平明顯降低，導致TRAF3降解受阻，TRAF3蛋白表達量相對增高。并且抑制TRAF3的泛素化降解可以負性調控MAPK信號激活，正性調控TRIF信號活化，使促炎因子IL-1和TNF-α產生減少，抗炎因子IL-10產生增多，從而誘導Kupffer細胞產生內毒素耐受。故TRAF3可能在內毒素耐受的形成中發揮著重要的作用。

4 前景與展望

目前，TRAF3在疾病中的作用逐漸被認識。從多發性骨髓瘤患者體內分離出的惡性細胞中，發現TRAF3基因缺失或者功能障礙。其可能原因是TRAF3基因的點突變導致其個別氨基酸被替代(R118W)，使得TRAF3蛋白的穩定性下降，進而導致其失去正常的生物學功能；TRAF3的突變導致NIK以及NF-κB的信號激活，使腫瘤細胞的存活率增高[21]。然而，在膿毒癥以及相關炎癥性疾病患者中是否存在TARF3 基因表型變異或者蛋白功能變化還不得而知，加強相關方面的基礎與臨床研究將為炎癥性疾病提供新的治療思路。

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TRAF3 endotoxin tolerance，the research progress of the role and its related mechanism

KE Min，LI Yun-bi

R392

B

1672-6170(2015)06-0157-03

2015-07-25；

2015-08-02)

△通訊作者，碩士生導師