蝦類原肌球蛋白提取和活性的保持

李　洋，薛　璐，胡志和，吳子健，王麗娟

（天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津市食品生物技術重點實驗室，天津300134）

蝦類原肌球蛋白提取和活性的保持

李洋，薛璐*，胡志和，吳子健，王麗娟

（天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津市食品生物技術重點實驗室，天津300134）

蛋白質分離純化的主要目的是研究其結構和理化性質，因此在分離純化過程中應盡量保持原有的結構和性質。本文主要綜述了甲殼類動物的主要過敏原-原肌球蛋白（Tropomyosin，TM）的結構，以及影響其結構穩定性的因素。同時討論了分離純化的方法及條件對原肌球蛋白結構和過敏原活性的影響，為提取高純度且保留原有結構和活性的原肌球蛋白提供參考。

原肌球蛋白，純化，結構，過敏原活性

蛋白質分離純化的主要目的是研究其結構和理化性質。因此，在進行蛋白質純化的過程中，應盡量采用較溫和的方法和條件，保留其原有的結構和性質。原肌球蛋白已經被確認為是甲殼類動物的一個主要過敏原［1-2］，已成為甲殼類水產致敏性消減研究的熱點。因此，如何獲得高純度，且能夠保留原有結構和性質的原肌球蛋白（Tropomyosin，TM），對研究原肌球蛋白的結構及致敏性具有重要的意義。本文以蝦主要過敏原原肌球蛋白為對象，綜述了其結構和在提取純化中影響其過敏原性的因素及相應的措施，介紹了近年來原肌球蛋白提取純化的方法及活性保持的效果，為提取高純度且保留原有結構和活性的原肌球蛋白提供參考。

1　蝦原肌球蛋白

原肌球蛋白是甲殼類動物的主要過敏原，其中原肌球蛋白Pen a1研究較為清楚。原肌球蛋白（Tropomyosin，TM）是α螺旋的二聚物，含有極少的β-折疊和β-轉角等結構，兩條α鏈形成一個卷曲螺旋結構，位于肌動蛋白細絲的螺旋鏈上，它們首尾相連，形成連續的單元［3］。研究顯示，其分子量在32～38ku，等電點在4.5左右，是一種酸性糖蛋白，含糖量約為2.9%，溶于水及鹽溶液，具有熱穩定性［4-6］。它的功能是調節肌動蛋白-肌球蛋白相互作用和穩定肌動蛋白纖維結構。原肌球蛋白幾乎存在于所有的真核細胞中，是多樣化的組織蛋白，在不同動物組織中有不同的亞型。

另外，甲殼類動物的原肌球蛋白具有相對保守的氨基酸序列，蝦原肌球蛋白包括中國對蝦（Pen a1）、印度對蝦（Pen i1）、斑節對蝦（Pem 1）、刀額新對蝦（Met e1）、凡納濱對蝦（Lit v1）的序列相似度高達93%～99%［7］。經過同源性的比較，可以獲得蛋白質可能具有的功能，及某些相似的特點和性質［8］。不同亞類間的原肌球蛋白的抗原表位區域雖分布不同，但其抗原決定簇片段具有交叉重疊部分，過敏者IgE與不同甲殼動物的原肌球蛋白會有很高的交叉反應，甚至與塵螨、蟑螂等無脊椎動物的原肌球蛋白也具有交叉反應。

2　影響原肌球蛋白結構與其免疫活性的因素

穩定原肌球蛋白結構的因素有蛋白質中的氫鍵及糖基、疏水作用、范德華力、靜電作用力等［9］，這些因素有著不同的作用點。Zheng等利用3種免疫信息學工具預測了斑節對蝦原肌球蛋白的潛在IgE線性表位，確定其過敏原表位大部分位于原肌球蛋白的螺旋結構內［10］。破壞蛋白抗原決定簇的序列會引起其免疫活性的變化。孫佳益［11］利用胰蛋白酶處理南美白對蝦的原肌球蛋白后，western blotting結果中無36ku的特異性條帶，說明當過敏原蛋白抗原決定簇序列受到破壞時，過敏原蛋白的免疫活性會喪失。

糖鏈的存在會提高蛋白的熱穩定性及過敏原性，王曉斐［12］發現中國對蝦主要過敏原Pen c1去糖基前的熱變性溫度為136.60℃，而去糖基后的熱變性溫度為115.55℃。隨后，采取酶切法去糖基后，經ELISA檢測，發現其免疫活性略有降低。同時，美拉德反應使原肌球蛋白發生糖基化后，免疫活性也會明顯降低［13］。

疏水作用使蛋白質在水溶液中埋藏非極性表面，有利于其保持熱穩定性，從而穩定蛋白質的結構［14］。顧可飛等經輻照處理對蝦主要過敏原Pen a1后，發現其疏水基團暴露，當達到一定劑量（7kGy）時，部分疏水基團被破壞或受到掩蓋，蛋白質發生分解、交聯等變化，從而喪失了活性［15］。隨著離子強度的增強，原肌球蛋白與細肌絲中肌鈣蛋白之間的結合力也會減弱，不利于其保持穩定性［16］。

此外，在原肌球蛋白提取純化的過程中，提取溫度、提取溶劑、儲藏時間等均可能對以上因素造成影響，從而影響原肌球蛋白的活性保持。

3　蝦過敏原蛋白的提取純化方法及活性保持

3.1原肌球蛋白的提取及純化方法

1981年Hoffman等［17］最先報道了棕蝦（Penaeus aztecus）中引起過敏反應的過敏原是分子量為36ku的蛋白質。接著Daul等［18］發現36ku的蛋白質是棕蝦的主要過敏原，命名為Pen a1。1993年Shanti等［19］分離出印度對蝦（Panulirus stimpsoni）的主要過敏原Sa-II，為34ku的原肌球蛋白，含有300個氨基酸殘基，并證實其IgE結合表位為肽鏈的50～66和153～161片段。2010年Rahman等［20］分離了黑虎蝦（Penaeus monodon）的具有免疫活性的主要過敏原，為分子量33ku的原肌球蛋白。2012年Mohamad Yadzir等［21］分離了羅氏沼蝦（giantfreshwater prawn）中分子量為36ku的主要過敏原原肌球蛋白。同年，Myrset等［22］重組了北方甜蝦的原肌球蛋白Pan b1，并用于診斷和進一步研究原肌球蛋白變應原性和特定的免疫治療。近年來，張華、吳序櫟等［23-24］分離純化了刀額新對蝦、斑節對蝦的主要過敏原，經過western blotting反應鑒定，為原肌球蛋白。張在軍等［25］分離純化了河蝦的主要過敏原原肌球蛋白，并驗證了其sIgE結合活性。

目前根據已有不同來源的原肌球蛋白的提取、純化研究，原肌球蛋白的提取純化分為三個步驟：首先是蝦纖維蛋白粉的制備，將去頭、去殼、去尾的新鮮蝦體組織在一定離子強度的緩沖液中（pH7.0～7.5），低溫下勻漿，經過緩沖液的重復洗滌，離心收集沉淀，去除大部分肌漿蛋白；然后用預冷（-20℃）過的有機溶劑，如乙醇、乙醚或丙酮等，重復抽提，離心或用紗布過濾，去除脂肪；同時可以沉淀一些不需要的蛋白，將所得沉淀經自然風干得到蝦纖維蛋白粉末［26-28］。早在1993年，Shanti等［19］就利用乙醚反復處理蝦肉，得到蝦纖維蛋白粉末。2006年Fuller等［29］用低鹽緩沖液（內含有20mmol/L KCl、1mmol/L KHCO3、0.1mmol/L CaCl2和0.1mmol/L DTT）除去勻漿后的中國對蝦蝦泥中的肌漿蛋白，所收集得到的沉淀先用預冷的乙醇洗滌兩次，再用預冷乙醚處理兩次，所得沉淀經自然風干就可獲得中國對蝦纖維蛋白粉。在采取以上措施時，原肌球蛋白的活性能夠得到保留。因此以蝦纖維蛋白粉為原料進行原肌球蛋白的浸提，采用pH為7.0～8.0的含1mol/L KCl的緩沖液進行反復浸提，離心取上清，合并浸提液即為蛋白提取液［30-32］，增加提取次數可獲取更多的樣品。另外，因原肌球蛋白的結構具有較好的熱穩定性，也可通過加熱獲得原肌球蛋白粗提液。林江偉等［33］將新鮮的克氏原螯蝦肉在磷酸緩沖液（PBS，10mmol/L，pH=7.0，含3%的NaCl）中搗碎，沸水浴15min，獲得了蝦蛋白提取液，western blotting中，與13份甲殼類過敏患者血清呈陽性反應，反應率為100%。

第二步是以蛋白粗提液為原料，采用硫酸銨鹽析法或等電點沉淀法獲得原肌球蛋白粗品。在此過程中，硫酸銨鹽析不僅能獲得一定純度的原肌球蛋白，還可保持過敏原的活性。張在軍［34］通過飽和度為90%硫酸銨鹽析，獲得粗提的原肌球蛋白，免疫斑點法（Dot-ELISA）證明目的蛋白能與特異性IgE反應。陳同強等［35］分離純化了中國龍蝦的主要過敏原，利用飽和度為45%硫酸銨鹽析，然后將沉淀復溶，調節pH至4.5，進行等電點沉淀，獲得原肌球蛋白，Dot-ELISA結果顯示其具有較高活性。林江偉等［33］將克氏原螯蝦蛋白提取液進行飽和度為40%～60%的硫酸銨鹽析，取沉淀復溶并進行沸水浴，收集上清液即為原肌球蛋白，western blotting實驗中，呈明顯陽性反應。劉光明等［36］經等電點沉淀及飽和度為41%的硫酸銨鹽析，沉淀出了南美白對蝦的原肌球蛋白，western blotting實驗中，與9例蝦過敏人血清均有反應。硫酸銨鹽析取沉淀后，可用相同濃度的飽和硫酸銨溶液進行洗滌，去除一些雜蛋白［37］。

純化的最后一部分通常是利用層析技術進行原肌球蛋白的純化，如分子篩層析、離子交換層析、HPLC技術。Emoto等［38］利用反相高效液相色譜（TSKgel ODS-120T柱）除去美國龍蝦原肌球蛋白中的少量雜質。Rahman等［39］利用強堿性陰離子交換層析柱純化了黑虎蝦的主要過敏原。黃建芳等［40］經過葡聚糖G-50凝膠層析及DEAE陰離子交換層析，純化了河蝦的主要過敏原原肌球蛋白，純度達到94.2%，且western blotting陽性反應率為63.6%，過敏原活性相對最強。

另外，黃素文等［41］根據甲殼類的泛過敏原原肌球蛋白基因的高度保守性設計簡并引物，通過RTPCR克隆出淡水小龍蝦蝦肉中過敏原原肌球蛋白的全長基因。并將該基因連接入大腸桿菌，經誘導表達、Ni2+親和層析柱純化，獲得重組原肌球蛋白純品Pro c1，經過western blotting鑒定，與過過敏人血清反應率為80%，具有良好的免疫活性。

目前用于制備原肌球蛋白粗品的方法較為成熟，人們都是利用前面所述的方法來制備蝦纖維蛋白粉以及鹽溶液浸提，鹽析沉淀可分離得到有一定純度的原肌球蛋白粗品。在此過程中，均采取低溫操作，根據原肌球蛋白鹽溶的特性選擇適宜濃度的鹽溶液作為提取劑，鹽析時使用硫酸銨粉末或飽和硫酸銨溶液，獲得具有一定純度及活性的原肌球蛋白。在利用層析技術進行純化時，通常將離子交換與凝膠過濾層析相結合，凝膠過濾層析復性蛋白質操作步驟簡單，介質和蛋白質之間沒有吸附，影響因素也相對較少［42］，有利于蛋白質活性的保持。HPLC法所用的儀器、耗材昂貴，制備規模小且樣品不易回收，蛋白的免疫活性難以保持。另外，利用分子克隆法獲得的樣品，又可能存在生物安全性問題。

3.2原肌球蛋白活性保持的方法

采取以上措施進行原肌球蛋白提取純化時，為了保持原肌球蛋白的過敏原活性，可以采取以下措施。

在對蝦組織進行預處理，使其充分釋放出提取物時，所有的步驟在低溫條件下操作。因為高溫水溶液條件下，蛋白酶的存在會造成Asp的肽水解、Gln和Asn側鏈的脫氨基、Cys側鏈的β-去除及二硫鍵交換，從而對肽鏈再折疊產生極其嚴重的影響［43］，同時劇烈的攪拌也會造成蛋白活性的損失。研究發現加熱處理5min后的過敏原蛋白免疫活性降低了53%。盡管原肌球蛋白因具有異常穩定的α螺旋而具有熱穩定性［44］，但在蛋白質提取過程中，加熱與否及加熱的程度仍會通過改變其空間構象來影響蛋白的提取率及活性。

在蛋白浸提時，不同溶劑的提取效果不同，可以根據蛋白質的可溶性及酸堿性等具體情況來選擇提取液［45］。大部分蛋白都溶于水、稀鹽、稀酸或稀堿溶液，少數與脂類結合的蛋白質可溶于乙醇、丙酮等有機溶劑中。因此，在實際操作中，選擇適合的提取液不但可達到提取去雜的目的，還有利于保持蛋白的天然結構。原肌球蛋白為可溶于水溶液及鹽溶液，提取過程中，為了提高提取率和保持蛋白的活性，可加入一些保護劑，如二硫蘇糖醇（DTT），它可以打開蛋白質中半胱氨酸之間形成的二硫鍵，防止形成晶體蛋白高分子聚合物，使蛋白質保持原有的構象［46］。吳麗莎［47］通過間接ELISA檢測不同提取液對蛋白活性的影響，發現加入DTT的提取液抽提蛋白的過敏原性顯著（p＜0.05）高于未加入DTT的提取液抽提的蛋白。同時，加入低濃度的鈣離子也可以穩定原肌球蛋白結構，有利于保持其天然構象［48］。

原肌球蛋白粗品通常是利用鹽析法，該過程中鹽的種類及酸和鹽的加入順序會影響鹽析的效果。蝦蛋白提取中常用的是硫酸銨，因為飽和硫酸銨溶液的pH在4～5之間，靠近原肌球蛋白的等電點（pI4.6）。且硫酸銨對蛋白質有相當好的穩定作用，溶解度很大，用量少，而Na2SO4飽和溶液則相反。NH4NO3的溶解度雖然很大，但鹽析時比（NH4）2SO4、Al2（SO4）3需要的量大，這可能是因為NH4NO3在溶液中電離出的電荷數少［49-50］。在鹽析過程中，為了避免蛋白溶液體積的變化，可以選擇緩慢的加入硫酸銨粉末，緩慢攪拌，以免造成溶液局部鹽濃度過高而引起蛋白的變性。為了更好的保持過敏原的活性，在允許蛋白溶液體積變化時，也可選擇滴加飽和硫酸銨溶液，相比加入硫酸銨粉末更溫和。研究發現，提高鹽析次數可達到更好的純化目的，并且蛋白活性不會有太大損失［51］。另外，獲得的過敏原提取物最好低溫保存，避免反復凍融而引起過敏原活性的變化。研究表明，獲得的蝦過敏原提取物在-20℃和-80℃儲存5周時，蛋白濃度下降了5.71%和5.00%，可能是因為從蝦中提取的蛋白，本身就含有分解蛋白的酶，且冷凍、解凍速度影響冰晶的形成從而影響蛋白含量［52-53］，但是提取物的過敏活性保持不變。除了儲存時間，蛋白提取物的反復凍融也會影響蛋白的活性，在-80℃和-20℃凍融循環4次時，主要過敏原條帶會發生降解［54］。

最后，利用層析技術純化蛋白不僅會使部分蛋白損失，層析的溶液環境和固相介質也會引起蛋白質的結構變化，雖然結構變化了的蛋白質也可能重新折疊恢復活性，但是部分天然的蛋白質可能會降低活性甚至完全失去活性［55］。因此，層析過程中緩沖體系、流速、上樣量的選擇就顯得尤為重要。研究顯示，在凝膠層析過程中，大體積低蛋白質濃度進料時其復性率高，同時還發現較慢的洗脫流速能夠減少蛋白質聚集的機會［56］。另外，層析和鹽析純化的蛋白，都需要透析、冷凍干燥后回收，而在冷凍干燥過程中，蛋白質可能在凍結過程中變性。大多數研究者認為蛋白質分子周圍分布著多層水分子，只要蛋白質分子表面的單層水分子沒有凍結，則蛋白質就不會變性；反之，蛋白質就會變性［57］。因此在冷凍干燥蛋白質的過程中，可以加入保護劑，防止由于蛋白質表面的單層水分子破壞而引起的蛋白質變性。常用的保護劑種類有多羥基化合物、糖、蛋白質、聚合物、氨基酸、鹽、胺、表面活性劑等［58］。

4　結論

原肌球蛋白結構性質的深入研究和對其提取純化過程中活性保持因素的了解，可為揭示過敏反應與蛋白結構之間的關系提供一定的參考。然而，由于不同品種蝦的過敏原之間存在差異，對不同來源的過敏原的生物化學本質、組成、含量等的認識還不全面，獲得具有活性的高純度原肌球蛋白則需要以提取及純化技術的改進和提升為基礎。

目前國內外研究集中于對海蝦主要過敏原原肌球蛋白的結構及表位確定方面，關于過敏原刺激機體產生過敏反應的具體機理及非主要過敏原與主要過敏原關系的研究較少。純化過程中非主要過敏原的減少或消失，對主要過敏原免疫活性變化的影響等方面仍需要進行研究。

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Extraction and activity remained of shrimp tropomyosin

LI Yang，XUE Lu*，HU Zhi-he，WU Zhi-jian，WANG Li-juan
（Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology，College of Biotechnology and Food Science，Tianjin University of Commerce，Tianjin 300134，China）

The main purpose of the separation and purification of proteins was to study its structure and physicochemical properties，so the original structure and properties should be kept during the separation and purification.The paper reviewed the structure of major allergen of crustaceans-tropomyosin（Tropomyosin，TM），and the factors of effecting its structural stability.And the effect of separation methods and conditions on TM’s structure and allergen activity was also discussed，which provided a reference for the extraction of tropomyosin with high purity and original structure and activity.

tropomyosin；purification；structure；allergen activity

TS254.1

A

1002-0306（2015）10-0395-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.10.075

2014－09－11

李洋（1989-），女，碩士研究生，研究方向：食品生物技術。

薛璐（1976-），女，博士，副教授，研究方向：專用功能食品。

國家自然科學基金面上項目（31271841）；天津市高等學校創新團隊項目（TD12-5049）。