FoxM1、Cep55和c-Myc蛋白在基底細胞樣乳腺癌中的表達及臨床意義

馬秋雙 周炳娟 張金庫 趙文明 趙亞飛

基底細胞樣乳腺癌(basal-like breast carcinoma，BLBC)是指具有基底細胞基因表型并伴有不同程度基底細胞角蛋白和(或)肌上皮標記物表達的乳腺癌。BLBC約占全部乳腺癌的8%～20%，具有獨特的組織形態特點、易發生遠處轉移、對傳統的內分泌治療無效、無病生存期與總體生存率均較其他類型的乳腺癌差［1］。目前，對于BLBC的發病機制及影響預后的相關因素尚不清楚。癌癥發生重要的環節之一是對轉錄水平的調節，本研究通過免疫組化方法檢測細胞周期中重要的轉錄因子FoxM1及其下游基因Cep55在BLBC中的表達情況，以探討其在BLBC發生、發展中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集保定市第一中心醫院病理科2007至2012年手術及會診的乳腺癌存檔蠟塊450例，全部標本均經病理證實。所有乳腺癌患者均為女性，術前均未行新輔助化療和放射治療。標本均常規取材，10%甲醛固定，常規石蠟包埋，4 μm厚連續切片。根據目前公認的BLBC的免疫表型診斷標準［ER/PR、HER-2陰性，CK5/6 和(或)EGFR 陽性］，篩選出BLBC病例66例［年齡24～71歲，平均年齡(48±12)歲］及癌旁正常癌旁乳腺組織(距腫瘤邊緣5 cm)66例，NON-BLBC 70例［年齡22～85歲，平均(51±18)歲］。

1.2 試劑 兔抗人FoxM1多克隆抗體購自美國Abcam公司，兔抗人Cep55多克隆抗體購自北京博奧森公司，兔抗人c-Myc多克隆抗體，兔抗人ER、兔抗人PR、兔抗人HER2、鼠抗人 CK5/6、鼠抗人 EGFR、即用型快捷免疫組化MaxVisionTM檢測試劑盒和對氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒均購自福州邁新公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化:采用免疫組化方法(EnVision二步法)檢測BLBC、NON-BLBC及癌旁乳腺組織中FoxM1、Cep55的表達情況，所有操作步驟均依據產品說明書進行，采用檸檬酸修復液(pH值6.0)高溫高壓修復抗原，以FoxM1、Cep55及c-Myc陽性的胃癌組織作為陽性對照，以磷酸鹽緩沖液(PBS)替代一抗作為陰性對照，對氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木精復染，中性樹膠封固。

1.3.2 結果判定:FoxM1陽性表達顯示棕黃色均勻細顆粒位于細胞核，少量出現于胞漿，Cep55陽性表達顯示棕黃色均勻細顆粒位于細胞漿，c-Myc陽性表達棕黃色均勻細顆粒位于細胞核。免疫組化結果由兩位高年資病理醫師采用盲法高倍鏡下對每張切片隨機選擇5個視野，每個視野計數100個細胞，采用半定量計分方法，根據著色強度(A)和陽性細胞所占比例(B)兩者乘積來判定。(A)著色強度按下列標準評定記分:無色0分，淡棕色1分，棕黃色2分，棕褐色3分;(B)陽性細胞所占比例按下列標準評定記分:＜25%為1分，26% ～50%為2分，51% ～75%為3分，＞75%為4分。兩項得分相乘(A×B)，將結果分為4個等級:陰性(0～1分)、弱陽性(2～4分)、中度陽性(5～8分)、強陽性(9～12分)，＞2分視為陽性結果［2］。

1.4 統計學分析 應用SPSS 17.0統計軟件，FoxM1、Cep55及c-Myc蛋白的表達及其與BLBC的臨床病理因素的分析采用χ2檢驗，FoxM1、Cep55及c-Myc相關性分析采用spearman相關分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FoxM1、Cep55及c-Myc蛋白在 BLBC和癌旁正常乳腺組織中的表達情況

2.1.1 FoxM1蛋白免疫組化的陽性表達顯示棕黃色均勻細顆粒，主要位于細胞核，少量出現于胞漿。FoxM1蛋白在BLBC、NON-BLBC及癌旁正常乳腺組織中的陽性表達率分別為77.3%(51/66)、60.0%(42/70)和13.6%(9/66)。BLBC中FoxM1蛋白的陽性表達率明顯高于NON-BLBC和正常組，差異有統計學意義(P＜0.05)。而基底細胞樣乳腺癌組與非基底細胞樣乳腺癌組相比，c-Myc的陽性率差異有統計學意義(P＜0.05)。見表1，圖 1。

圖1 FoxM1在BLBC中的陽性表達(IHC×100)

2.1.2 Cep55蛋白免疫組化的陽性表達顯示棕黃色均勻細顆粒，位于細胞漿。Cep55蛋白在BLBC、NONBLBC及癌旁正常乳腺組織中的陽性表達率分別為74.2%(49/66)、57.1%(40/70)和 16.7%(11/66)。BLBC中Cep55蛋白的陽性表達率明顯高于NONBLBC和正常組，差異有統計學意義(P＜0.05)。而基底細胞樣乳腺癌組與非基底細胞樣乳腺癌組相比，c-Myc的陽性率差異有統計學意義(P＜0.05)。見表1，圖2。

圖2 Cep55在BLBC中的陽性表達(IHC×100)

2.1.3 c-Myc蛋白免疫組化的陽性表達顯示棕黃色顆粒，主要位于細胞核。c-Myc蛋白在 BLBC、NONBLBC及癌旁正常乳腺組織中的陽性率分別為71.2%(47/66)、64.3%(45/70)和 22.7%(15/66)。BLBC中c-Myc的陽性率高于NON-BLBC和正常組，差異有統計學意義(P＜0.05)。而基底細胞樣乳腺癌組與非基底細胞樣乳腺癌組相比，c-Myc的陽性率差異有統計學意義(P＜0.05)。見表1，圖3。

表1 FoxM1、Cep55及c-Myc在3組中的表達情況 例(%)

圖3 c-Myc在BLBC中的陽性表達(IHC×100)

2.2 FoxM1、Cep55 及 c-Myc蛋白的關系

2.2.1 FoxM1蛋白與 Cep55蛋白在BLBC中的表達呈正相關關系(r=0.259，P＜0.05)。見表2。

表2 FoxM1、Cep55在BLBC中的表達關系 例

2.2.2 FoxM1蛋白與c-Myc蛋白在 BLBC中的表達呈正相關關系(r=0.294，P＜0.05)。見表3。

表3 FoxM1、c-Myc在BLBC中的表達關系 例

2.2.3 Spearman相關分析檢驗得出，Cep55蛋白與c-Myc蛋白在BLBC中的表達無相關性(r=0.221，P＞0.05)。見表4。

表4 c-Myc、Cep55在BLBC中的表達關系 例

2.3 FoxM1、Cep55及c-Myc蛋白的表達與 BLBC臨床病理因素的關系 FoxM1蛋白、Cep55蛋白及c-Myc在BLBC中的表達與淋巴結轉移及TNM分期有關(P＜0.05)，而與年齡、絕經與否、腫瘤大小無關(P＞0.05)。見表5。

表5 FoxM1、Cep55及c-Myc的表達與BLBC臨床病理特征的關系

3 討論

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，嚴重影響著女性的生存及生活質量，目前根據cDNA組織芯片基因表型將乳腺癌分為5種分子亞型，即管腔A型(luminal subtype A)、管腔B型(luminal subtype B)、正常乳腺樣型(normal breast-like subtype)、HER-2過表達型(HER-2 over-expression subtype)以及基底細胞樣型(basal-like subtype)［3］。作為新近發現的乳腺癌亞型，基底細胞樣乳腺癌以其獨特的組織學形態、較差的生物學行為越來越多的引起醫學界的關注，本研究采用免疫組化的方法初步探討了與BLBC發生、發展密切相關的因素，以期為BLBC尋找特異性的基因治療靶點提供理論依據。

轉錄水平的調控是癌癥發生的一個重要方面，同時也是基因靶向治療的一個方向［4］。FoxM1是Forkhead Box(Fox)轉錄因子家族的重要成員之一，位于染色體12p13.3，全長約 25kb，具有 A、B、C3 個亞型［5］。FoxM1在多種惡性腫瘤組織中過表達，如胃癌［6］、胰腺癌［7］、肝癌［8］、大腸癌［9］和宮頸癌［10］等。其可能機制為參與細胞周期的調控，促進G1/S的過渡導致腫瘤細胞增殖［11］;調節VEGF的信號通路，促進腫瘤新生血管的形成［12］;激活參與 ECM 降解酶(如 MMPs)的轉錄促進腫瘤的浸潤與遷移［7］;參與并維持干細胞多能性等［13］。本研究發現，FoxM1蛋白在BLBC中的陽性表達率明顯高于癌旁正常乳腺組織及NON-BLBC，提示FoxM1可能與BLBC的發生、發展有關，同時數據顯示FoxM1蛋白的表達與BLBC的TNM分期及淋巴結轉移相關，表明FoxM1的過表達與BLBC的侵襲能力密切相關，可能是BLBC預后不良的原因之一。

中心體是哺乳動物細胞內的微管組織中心，參與紡錘體的裝配，在胞質分裂中起重要調控作用。最新發現的中心體相關蛋白Cep55(centrosomal protein，55 kD)屬于卷曲螺旋(coiled-coil)蛋白質家族成員，其基因定位于人染色體 10q23.33［14，15］。該蛋白質在多種正常組織及腫瘤細胞中均有表達。Cep55參與細胞周期中的中心體和中間體偶聯，被Erk2、Cdk1及Plk1共同磷酸化后發揮細胞周期調控作用［16］。本研究結果顯示，Cep55蛋白在BLBC中的陽性表達率明顯高于癌旁正常乳腺組織及NON-BLBC，同時，Cep55蛋白的表達與BLBC的TNM分期及淋巴結轉移有關，提示Cep55蛋白的過表達可能參與BLBC的發生、發展。

Cep55是FoxM1的下游靶基因，與FoxM1共同參與調節細胞的分化、增殖、細胞凋亡以及維持干細胞多能性等生理過程［16］。Erk2是Ras-MAPK信號通路的信號分子，FoxM1使Ras-MAPK信號通路持續激活而影響Erk2的激活狀態，Erk2和Cdk1，Plk1在細胞周期中可依次將Cep55蛋白的S425/S428、S436磷酸化使其激活而發揮作用［17］。由此可見，FoxM1不但調控著Cep55的轉錄與生成，還通過Ras-MAPK信號通路影響其活性，這可能是FoxM1促進細胞增殖的機制之一。本研究結果顯示FoxM1與Cep55在BLBC中的表達呈正相關性，進一步支持FoxM1與Cep55之間的相互作用關系，并推測可能由于FoxM1的過表達增加了Cep55的穩定性，過表達的FoxM1單獨或與Cep55協同促進BLBC的侵襲、轉移。

c-Myc基因是一種序列特異性轉錄因子，其定位于染色體8q24.12-13，主要包括3個成員:c-Myc1、c-Myc2 和 c-MycS［18，19］。該基因主要激活方式是基因擴增、重排或過度表達［20］。其編碼蛋白定位于細胞核內，具有轉錄因子活性，有調節細胞周期、促進細胞增殖、刺激血管生成、抑制細胞分化、參與細胞凋亡等作用［21］。在肺癌、胃癌、肝癌等多種惡性腫瘤［22］中均異常表達。Rummukainen等［23］發現c-Myc基因擴增水平增高與乳腺癌中的組織學級別較高、PR陰性、DNA非整倍體、較高的S期指數等因素有關。張宏武［24］還發現在乳腺癌中c-Myc的基因擴增及蛋白過表達均與ER陰性顯著相關。另有研究發現c-Myc基因在luminal型和Her-2過表達型表達量低，而在基底細胞樣乳腺癌中表達水平較高［25，26］。本研究結果顯示，基底細胞樣乳腺癌組織中c-Myc蛋白的表達明顯高于正常乳腺組織及non-BLBC，且與BLBC的TNM分期及淋巴結轉移有關(P＜0.05)，提示c-Myc表達水平升高可能與基底細胞樣乳腺癌的發生、發展具有相關性，并且可能參與BLBC的侵襲。

同時c-Myc亦是FoxM1的下游靶基因，與FoxM1共同參與調節細胞的分化、增殖、細胞凋亡等生理過程。Guney等［27］現在受到FoxM1siRNA干擾的胃癌細胞中c-Myc的mRNA和蛋白表達水平都發生下調。本研顯示FoxM1與c-Myc在BLBC中的表達呈正相關性，說明FoxM1與c-Myc在基底細胞樣乳腺癌的發生、發展中存在協同關系，其相互作用的可能機制為:(1)作為一個常規的轉錄因子，通過與靶基因核心啟動子上游結點的結合(5’-A-C/TAAA-C/T-AA-3’)而發揮作用［28］;(2)FoxM1直接結合TATA盒框，轉錄活化人類c-MycP1和P2啟動子［29］過MEK/Erk1/2信號途徑抑制c-Myc的表達后，c-Myc通過與FoxM1啟動子序列的E-box元件相互作用下調FoxM1表達，降低c-Myc及其靶基因hTERT在內的下游基因的表達，構成了c-Myc-FoxM1的正反饋環，介導腫瘤細胞的生長抑制［30］。

Cep55與c-Myc之間的相互作用沒有文獻報道，而本實驗研究結果顯示二者之間沒有相關關系，說明兩者可能通過不同的作用途徑對基底細胞樣乳腺癌的發生發展及浸潤轉移產生影響，相關機制有待進一步實驗研究。

1 Lin Y，Lin S，Watson M，et al.A gene expression signature that predicts the therapeutic response of the basal-like breast cancer to neoadjuvant chemotherapy.Breast Cancer Res Treat，2010，123:691-699.

2 Song LB，Zeng MS，Liao WT，et al.Bmi1 is a novel molecular marker of nasopharyngeal carcinoma progression and immortalizes primary human nasopharyngeal epithelial cells.Cancer Res，2006，66:6225-6232.

3 Kapa AV，Jeffery SS，Lanferod A，et al.Discovery and validation of breast cancer subtypes.BMC Genomics，2006，7:231.

4 Ahmad A，Wang Z，Kong D，et al.FoxM1 down-regulation leads to inhibition of proliferation，migration and invasion of breast cancer cells through the modulation of extra-cellular matrix degrading factors.Breast Cancer Res Treat，2009，122:337-346.

5 崔健，郭泰林，茆燦泉.FoxM1的分子進化、結構與蛋白調控及與腫瘤的關系.腫瘤防治研究，2011，38:1329-1331.

6 Zeng J，Wang L，Li Q，et al.FoxM1 is up-regulated in gastric cancer and its inhibition leads to cellular senescence，partially dependent on p27 kip.J Pathol，2009，218:419-427.

7 王花，李雯.轉錄因子FoxM1與胰腺導管癌臨床病理特征和預后關系的研究.廣州:中山大學，2010.

8 Wang Z，Ahmad A，Banerjee S，et al.FoxM1 is a novel target of a natural agent in pancreatic cancer.Pharm Res，2010，27:1159-1168.

9 唐慧，鄒云蓮，朱軍，等.應用基因芯片技術篩選結直腸腺瘤-癌序列相關基因的初步研究.中華消化內鏡雜志，2009，26:527-532.

10 Chan DW，Yu SY，Chiu PM，et al.Over-expression of FoxM1 transcription factor is associated with cervical cancer progression and pathogenesis.Pathol，2008，215:245-252.

11 Nakamura S，Hirano I，Okinaka K，et al.The FOXM1 transcriptional factor promotes the proliferation of leukemia cells through modulation of cell cycle progression in acute myeloid leukemia.Carcinogenesis，2010，31:2012-2021.

12 Zhang Y，Zhang N，Dai B，et al.FoxM1B transcriptionally regulates vascular endothelial growth factor expression and promotes the angiogenesis and growth of glioma cells.Cancer Res，2008，68:8733-8742.

13 Bao B，Wang Z，Ali S，et al.Over-expression of FoxM1 leads to epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell phenotype in pancreaticcancer cells J Cell.Cell Biochem，2011，112:2296-2306.

14 Fabbro M，Zhou BB，Takahashi M，et al.Cdk1/Erk2-and Plk1-Dependent Phosphorylation of a Centrosome Protein，Cep55，Is Required for Its Recruitment to Midbody and Cytokinesis.Developmental Cell，2005，9:477-488.

15 李傳芬，荊文，杜會芹，等.調控胞質分裂的中心體相關蛋白Cep55.生命化學，2006，26:487-489.

16 Waseem A，Ali M，Odell EW，et al.Downstreamtargets of FoxM1:CEP55 and HELLS are cancerprogressionmarkers of head and necksquamouscellcarcinoma.Oral Oncology，2010，46:536-542.

17 Martinez-Garay I，Rustom A，Gardes HH，et al.The novelcentrosomalassociatedproteinCEP55 is present in the spindlemidzone and the midbody.Genomics，2006，87:243-253.

18 Xiao Q，Claassen G，Shi J，et al.Transactivation-defective c-MycS retains the ability to regulate proliferation and apoptosis.Genes Dev，1998，12:3803-3808.

19 Facchini LM，Penn LZ.The molecular role of Myc in growth and transformation:recent discoveries lead to new insights.FASEB J，1998，12:633-651.

20 McNeil CM，Serqio CM，Anderson LR，et al.c-Myc overexpression and endocrine resistance in breast cancer.Steroid Bioehem MolBiol，2006，106:147-155.

21 Hemann MT，Bric A，Teruya-Feldstein J，et al.Evasion of the p53 tumour surveillance network by tumour-derived MYC mutants.Nature，2005，436:787-789.

22 鄧君，饒紹琴，黃文芳.C-erbB2、c-Myc和CCNDl mRNA聯合檢測在乳腺癌診斷中的應用.實用醫院臨床雜志，2011，8:21-23.

23 Rummukainen JK，Salminen T，Lundin J，et al.Amplification of c-Myconcogene by chromogenic and fluorescence in situ hybridization in archival breast cancer tissue array samples.Lab Invest，2001，81:1545-1551.

24 張宏武.c-Myc、FAK、Her-2、CCND1及 TopoⅡa在乳腺癌中的變化及其與臨床病理指標的關系.北京:中國協和醫科大學，2007.

25 Sorlie T，Perou CM，Tibshirani R，et al.Geneexpression patterns ofbreastcarcinomas distinguishtumor subclasses with clinical implications.Proc Natl Acad Sci USA，2001，98:10869-10874.

26 Sotiriou C，Neo SY，McShane LM，et al.Breastcancer classification and prognosis based on geneexpression profiles from a population-based study.Proc Natl Acad Sci USA，2003，100:10393-10398.

27 Guney I，Wu S，Sedivy JM.Reduced c-Myc signaling triggers telomereindependent senescence by regulating Bmi-1 and p16(INK4a).Proc Natl Acad Sci USA，2006，103:3645-3650.

28 Wierstra I，Alves J.FOXM1c is activated by cyclin E/Cdk2，cyclin A/Cdk2，and cyclin A/Cdk1，but repressed by GSK-3alpha.BiolChem Biophys Res Commun，2006，348:99-108.

29 Wierstra I，Alves J.Despite its strong transactivation domain，transcription factor FOXM1c is kept almost inactive by two different inhibitory domains.Biol Chem，2006，387:963-976.

30 Cole MD，McMahon SB.The Myc oncoprotein:a critical evaluation of transactivation and target gene regulation.Oncogene，1999，18:2916-2914.