脂聯素在2型糖尿病合并膽囊結石形成中的作用

王春城 暴雷 郭懷斌 張萬星

脂聯素是脂肪細胞分泌的一種特異性的蛋白，其生物學作用極其廣泛，與許多臨床疾病息息相關。有報道稱脂聯素在人類血液中的濃度一般在5～30 mg/L［1］，循環脂聯素的濃度水平與人的肥胖程度、胰島素抵抗(IR)現象及2型糖尿病具有較高正相關性，而與體重指數(BMI)和高胰島素血癥呈負相關［2］。肥胖的小鼠注射脂聯素后，其IR出現減弱，且其血糖濃度有所降低［3］。這充分說明了體重的減少和脂聯素濃度的增加正是提高胰島素敏感性的有效方法，目前也有報道稱脂聯素可以改善糖尿病大血管病變情況［4］。研究發現，糖尿病患者中發生膽囊結石的幾率非常高，糖尿病合并膽囊結石患者的血清胰島素水平比非膽囊結石患者明顯升高。并且，只要胰島素水平出現持續輕度升高，不論性別或有無糖尿病病史，其膽囊結石的發生率均明顯增高［5］。糖尿病患者的膽汁中膽固醇過飽和或者類脂的成份明顯增加。由于膽囊收縮或者排空功能出現異常，導致過飽和的膽固醇膽汁發生淤滯、積蓄，從而促進膽囊結石的形成。因此，糖尿病在膽囊結石發病過程中具有非常重要的作用。有研究結果表明，膽囊膽固醇結石患者血清中的脂聯素水平也非常的低。但是，糖尿病合并膽囊結石患者血清脂聯素水平尚不明確，血清脂聯素水平在糖尿病并發膽囊結石的過程中具有何種作用也未見相關報道。脂聯素是否參與了糖尿病微血管病變的發生，并且對膽囊結石也有一定的影響有待進一步探討。因此，本試驗研究旨在通過檢測2型糖尿病、2型糖尿病合并膽囊結石患者以及正常人群血清脂聯素水平，并觀察血清脂聯素與患者的年齡、病程、體重指數(BMI)、糖化血紅蛋白(HbA1c)的含量、血脂［三酰甘油(TG)、總膽固醇(CH)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)］含量水平的關系，以明確血清脂聯素水平在2型糖尿病并發膽囊結石過程中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 所有入選試驗對象的年齡為31～64歲，中位年齡53歲。全部排除心、腦、肝、腎疾病。且3個月內未發生膽系以外的其他急性炎癥病史。所有入選對象分3組:(1)從入院的2型糖尿病患者中選取單純糖尿病患者(D組，29例);(2)糖尿病合并膽囊結石患者(D+G組，27例);(3)正常健康體檢者(對照組，34例)。3組間年齡、性別比差異無統計學意義(P＞0.05)。

1.2 入選標準 糖尿病:(1)具有典型癥狀，空腹血糖126 mg/dl(7.0 mmol/L)或餐后血糖≥200 mg/dl(11.1 mmol/L);(2)沒有典型癥狀，僅空腹血糖126 mg/dl(7.0 mmol/L)或餐后血糖 200 mg/dl(11.1 mmol/L)應再重復1次，仍達以上值者，可以確診為糖尿病;(3)沒有典型癥狀，僅空腹血糖126 mg/dl(7.0 mmol/L)或餐后血糖 200 mg/dl(11.1 mmol/L)糖耐量試驗2 h血糖200 mg/dl(11.1 mmol/L)者可以確診為糖尿病。膽囊結石按以下標準入選試驗:超聲波或X線發現膽囊陽性結石即可入選。

1.3 方法

1.3.1 血液標本采集:所有受試對象均在禁食10～12 h后的試驗日清晨空腹抽取肘靜脈血3 ml，置于普通試管中，立即室溫3 000 r/min離心10 min，分離血清，測HbA1c、血脂，其余血清分裝保存在－80℃冰箱中，待標本收集完畢，同一批測定血清脂聯素水平。

1.3.2 BMI計算:受試者清晨空腹排尿后，穿單衣、赤足、脫帽、站立位測身高、體重。身高值精確到0.1 cm;計重計上讀取體質量;精確到0.01 kg。BMI=體重(kg)/身高2(m2)。

1.3.3 血脂分析:TG用GP-PAP法進行測定，CH用COD-PAP法進行測定，HDL用沉淀法進行測定，LDL值則通過Friedewald公式:LDL=CH-TG/2.2-HDL計算而來。采用BECKMAN全自動分析儀測定。

1.3.4 HbA1c:采用 USA Bio-Rad分光光度儀測定。

1.3.5 血清脂聯素測定:采用酶聯免疫吸附測定法(ELISA)雙抗體夾心法原理定量測定，試劑盒由美國Market公司提供，設置標準孔、對照孔與測定孔。為了確保測量結果的準確性，試劑的配制和操作步驟均嚴格按說明書進行，嚴格遵守酶標實驗的基本要求。見表1。

表1 試劑盒組成成份

1.4 儀器及設備 見表2。

表2 儀器及設備

1.5 統計學分析 應用SPSS 13.0統計軟件，計量資料以±s表示，采用t檢驗，組間比較采用單因素方差分析(ANOVA);脂聯素與其他變量之間用多元線性回歸分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 脂聯素含量與OD值的關系 以標準品的濃度為橫坐標(c)，以OD值為縱坐標，繪制標準曲線，得到計算公式為 OD=0.2035c+0.0326(R2=0.9904)，將測定孔吸光度值代入，計算得脂聯素濃度(c)。見圖1。

圖1 脂聯素的標準曲線

2.2 3組檢查指標結果 患者年齡、BMI 3組差異無統計學意義(P＞0.05)，D組與D+G組患者病程(Duration)差異無統計學意義(P＞0.05);D組及D+G組患者血清TG含量、血清中CH含量、LDL含量、HbA1c含量均高于對照組，而D組與D+G組之間差異無統計學意義(P＞0.05)。D組及D+G組患者HDL的含量均低于對照組，且D+G組與D組比較進一步降低。見表1～3。

表1 3組年齡、BMI比較 ±s

表1 3組年齡、BMI比較 ±s

組別 年齡(歲) 病程(年) BMI(kg/m2)對照組(n=34)52.31 ±6.89 － 22.72 ±2.89 D 組(n=29) 51.63 ±6.63 7.63 ±2.63 24.17 ±3.13 D+G組(n=27)53.03 ±6.71 7.87 ±2.60 24.03 ±3.57

表2 3組TG、HDL、CH、LDL比較mmol/L，±s

表2 3組TG、HDL、CH、LDL比較mmol/L，±s

注:與對照組比較，*P ＜0.05;與 D 組比較，#P ＜0.05

組別TG HDL CH LDL對照組(n=34)1.46 ±0.33 1.09 ±0.17 2.71 ±0.42 0.96 ± 0.19 D 組(n=29) 1.21 ±0.32* 1.21 ±0.28* 2.55 ±0.70 0.79 ±0.20 D+G 組(n=27) 2.98 ±0.43*#0.92 ±0.20*# 5.14 ±0.76*# 2.86 ±0.21*#

表3 3組HbA1c、脂聯素比較 ±s

表3 3組HbA1c、脂聯素比較 ±s

注:與對照組比較，*P ＜0.05;與 D 組比較，#P ＜0.05

組別 HbA1c(%) 脂聯素(mg/L)對照組(n=34)3.51 ±0.83 8.69 ±0.84 D 組(n=29) 9.00 ±1.30* 4.41 ±0.77*D+G 組(n=27) 9.65 ±1.38*# 3.86 ±0.64*#

2.3 3組血清脂聯素結果比較 對照組血清脂聯素水平明顯高于D組(t=4.28，P＜0.05)及D+G組(t=4.83，P＜0.05);D組血清脂聯素水平高于D+G組(t=0.54，P＜0.05)。見表3。單因素方差分析結果顯示各組血清脂聯素濃度之間差異有統計學意義(P＜0.01)。見表4。

表4 方差分析3組脂聯素水平比較

2.4 單因素相關分析

2.4.1 血清中脂聯素的含量與HDL的含量呈正相關(r=0.90)。見圖2。

圖2 HDL與血清脂聯素的關系

2.4.2 血清中脂聯素的含量與患者的BMI和HbA1c的百分比呈負相關 (相關系數分別為 －0.77和－0.72)。見圖3、4。

圖3 BMI和血清脂聯素水平的關系

圖4 HbA1c和血清脂聯素水平的關系

2.4.3 血清中脂聯素的含量與患者的年齡、患者的病程、血清中 TG、CH、LDL的含量均無相關性(P＞0.05)。

2.5 多元逐步相關分析表明 糖尿病合并膽囊結石患者血清脂聯素的主要影響因素為患者的BMI、血清中HbA1c的百分比以及血清中HDL的含量。見表5。

表5 多元回歸分析結果

3 討論

膽囊結石的發病率近年來在我國呈逐步上升的趨勢［6］。也有學者認為2型糖尿病患者一旦發生了IR和高胰島素血癥，發生膽囊結石的概率也會極大增加［7］。本試驗結果發現，正常健康體檢者的血清脂聯素水平明顯高于糖尿病非膽囊結石患者及糖尿病合并膽囊結石患者;糖尿病非膽囊結石患者血清脂聯素水平高于糖尿病合并膽囊結石患者。因此，糖尿病合并膽囊結石患者血清脂聯素水平處于較低水平，在糖尿病合并膽囊結石發病過程中具有重要作用。并且，糖尿病合并膽囊結石患者的BMI、血清中HbA1c的百分比以及血清中HDL的含量對血清脂聯素水平的影響較大。

脂聯素在血清中的分子質量大約為28 kDa，又稱凝膠結合蛋白28，由白色脂肪組織合成和分泌。成熟后的脂聯素蛋白包括:一個膠原樣結構域、一個類似于補體C1q的結構域，分子之間形成三聚體的結構［2］。人類脂聯素蛋白分子由244個氨基酸組成，一般以三種不同的形式存在:(1)2個三聚體組成低分子量的復合體;(2)6個三聚體組成高分子量的復合體;(3)三聚體聚合為球形。脂聯素與細胞表面的脂聯素受體結合而發揮作用，脂聯素受體可分為兩種亞型(Adipo 1、Adipo 2)，這兩種受體亞型在人體內不同部位表達，脂聯素受體1亞型主要在骨骼肌中表達，脂聯素受體2亞型主要在肝臟表達。

研究顯示，經過糖基化修飾后的脂聯素在提高胰島素敏感性中發揮了重要作用［8］。另外，脂聯素還可以有效改善IR，IR程度決定著血清中脂聯素的水平。研究顯示，IR程度與血清中的脂聯素水平成負相關關系［8］。并研究還發現胰島素的增敏劑噻唑烷酮類藥物可以顯著提高普通人群、肥胖人群及2型糖尿病患者血清中的脂聯素水平，其機制與激活脂聯素啟動子，以及抑制扭轉腫瘤壞死因子α(TNF-α)的作用有較大的關系［9］。也有相關研究發現，脂聯素在動物體外可以抑制TNF-α等相關炎性因子，以及其他一些黏附分子的表達;脂聯素與炎性標志物C-反應蛋白之間呈負相關關系，在女性體內C-反應蛋白只要輕微地升高，其相應的血清中的脂聯素水平就會馬上降低。所以，脂聯素還具有一定的抗炎作用［10］。

在2型糖尿病患者中，其IR與脂代謝的紊亂是同步發生的，并具有密切關系。其中脂代謝的紊亂主要是指血漿中游離脂肪酸以及TG脂的濃度水平升高，那么血清脂聯素水平與血脂之間有何關系呢?正如胰島素對脂代謝有促進作用一樣，脂聯素與此同時也參與了脂代謝的一系列的過程［11］。研究顯示，血清中脂聯素的濃度水平與TG脂呈明顯的負相關性［12］。生理劑量范圍內的脂聯素能促進肝細胞內TG脂代謝的水平增加，能明顯地降低肥胖小鼠和2型糖尿病小鼠血清中高脂血含量，并改善IR。而本試驗研究結果卻發現，血清中脂聯素的含量與TG脂及膽固醇的含量之間并沒有相關性，而與高密度脂蛋白的含量呈正相關，與上述研究結論不太相符合，分析可能原因:(1)部分患者試驗前服用了降血脂類藥物，并嚴格遵守了糖尿病飲食的原則，所以患者血脂水平雖與正常人有差別，但沒有統計學意義;(2)由于試驗時間的限制和病例采集的困難，本試驗中樣本量較小，一共只有90例，而兩類的患者分別只有27例(糖尿病結合膽囊結石患者)和29例(單純糖尿病患者)。

糖尿病患者還存在著嚴重的糖代謝紊亂。其主要臨床特征之一就是血糖含量特別高。由于血糖受很多因素的影響，變化速率較快，例如飲食量、運動量以及是否服用降糖藥物均可影響血糖濃度，使試驗誤差增大。而HbA1c的濃度可以反映出取血前的8～12周血糖的總水平，以彌補空腹血糖只能反映瞬時血糖值的不足，記憶血糖值的波動性。糖化血紅蛋白的百分含量與血糖濃度呈正相關性，并且是不可逆的反應［13］。所以本試驗研究選用此指標能更好地反映糖代謝的紊亂程度與血清脂聯素濃度的關系。并且，本試驗研究的結果也提示糖化血紅蛋白HbA1c的百分含量與血清脂聯素的濃度呈負相關性。

脂聯素蛋白在脂肪細胞中的表達最為豐富，其基因編碼的易感基因位點對于2型糖尿病和代謝綜合征是非常敏感的，這說明脂聯素與這些疾病存在著必然的聯系。在脂蛋白代謝過程中，血清中脂聯素的水平與血液中的血脂含量呈負相關性，例如脂蛋白顆粒、TG脂以及極低密度脂蛋白-載脂蛋白B的含量等［14］。在基礎狀態中，血清中低水平脂聯素的濃度是預測將來患者患有2型糖尿病的預兆信號［15］。同樣有研究結果表明，膽囊膽固醇結石患者血清中的脂聯素水平也非常的低［16］。脂質及炎性因子的形成會被脂聯素所抑制，脂聯素不但能促進糖代謝過程，還能改善IR;它能加速脂肪酸的氧化，促進糖元的轉運及降低肝糖元的輸出，從而來增加胰島素的敏感性，改善IR。

正常健康人BMI在18～24 kg/m2，肥胖者BMI一般都大于24 kg/m2，正常的健康人體內脂聯素的水平比肥胖者要高。有研究發現，肥胖者經過一段時間的鍛煉，減肥，其BMI會一定程度的下降，其體內脂聯素的水平會有所回升［17］。本組實驗在去除了其他影響因素之外，得出的結果與上述文獻［17］結果一致，差異有顯著性。另外，本實驗研究入選的研究對象中，患者的糖尿病病程及年齡在各組間匹配一致，膽囊結石組和單純糖尿病組患者的病程及年齡基本上沒有差別，當去除其它原因后，沒有發現血清中脂聯素的水平與患者的病程及患者年齡之間存在任何的相關性，與國內外的研究結果也是一致的［18］。但是，對于它們之間的是否有無關系還有待進一步的研究確證。

以往研究發現，高密度脂蛋白的含量下降、低密度脂蛋白含量的升高、極低密度脂蛋白含量的升高是2型糖尿病并發膽囊結石的危險因素［19］。本研究提示，低血清脂聯素水平也是2型糖尿病并發膽囊結石的一項高危險因素。首先，糖尿病患者血清中脂聯素的含量減少，從而引起游離脂肪酸大量的堆積、積蓄，使患者體內的高密度脂蛋白分解代謝突然增高、加劇，低密度脂蛋白合成代謝大量增加，導致高密度脂蛋白/低密度脂蛋白比例失常［19］。并且，血清中脂聯素水平的降低還會引起肝臟對胰島素的敏感性急劇下降，繼而引起血漿中游離脂肪酸濃度的上升［19］。

另一方面，由于進入肝臟的游離脂肪酸增多，刺激肝臟代謝，膽固醇和低密度脂蛋白在肝臟中產生增加，在IR的情況下，其又可引起脂蛋白脂酶活性降低、減弱，使低密度脂蛋白的降解非常緩慢，進一步導致低密度脂蛋白在血液中的含量緩慢升高，且使其轉變為高密度脂蛋白的過程出現障礙，導致血液中高密度脂蛋白的濃度慢慢下降，從而使糖尿病患者的脂代謝過程發生異常，促使膽汁中的膽固醇呈過飽和狀態，促進膽囊結石的形成［19］。血液中膽固醇的濃度較高時，可使膽汁中膽固醇濃度同樣相應的升高，兩者共同的作用使膽汁中的膽鹽含量、膽固醇含量及卵磷酯的穩定三角關系被打破，從而易形成膽固醇結石。AMP活化蛋白激酶途徑還可被脂聯素激活，增加其磷酸化的程度，使其活性大大提高，引起下游一系列分子的改變［19］。

還有研究報道，脂聯素可通過調節腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的表達調節膽囊慢性炎癥過程，繼而參與膽囊結石的形成［17］。脂聯素還可通過調節TNF-α的表達刺激NF-κB在內皮細胞中的活性，繼而激活炎癥相關信號通路，從而導致炎性因子及黏附因子的表達大大增強［20］。脂聯素的低表達還可能會引起糖尿病患者自主神經興奮性增高，使其膽囊體積增大，出現膽囊排空障礙，以至于膽汁淤滯于膽囊，出現膽囊結石［21］。

綜上所述，糖尿病合并膽囊結石患者的病死率比單純糖尿病患者的病死率要高出2倍多［22］，糖尿病患者合并膽囊結石在臨床上也是較為常見的情況，并且大多造成了嚴重的并發癥。最近幾年來，也有學者提出了一些糖尿病及其代謝綜合征的治療措施，例如上調血清中脂聯素的水平濃度、上調脂聯素受體表達、或者研制脂聯素受體激動劑等方法［22］。本研究表明了血清脂聯素水平與糖尿病易合并膽囊結石有關，與糖尿病膽囊結石患者的BMI、血清中HbA1c的百分比以及血清中高密度脂蛋白的含量有關，為糖尿病合并膽囊結石的發病機制及其病理基礎提供了理論依據，為膽囊結石的臨床治療提供新的思路。總之，血清脂聯素水平在糖尿病患者膽囊結石形成過程中具有重要作用。

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