上調(diào)miR-34c抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移及侵襲

武震東 任洪波 孫志強(qiáng) 劉斌 牛國棟 焦保華

miRNAs是一種約22個核苷酸長度非編碼單鏈小RNA，其本身不具有翻譯蛋白質(zhì)的功能，而是通過與mRNA的3’端非翻譯區(qū)(3’UTR)的堿基序列互補(bǔ)配對在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因表達(dá)。miRNA與mRNA能進(jìn)行完全或近乎完全的互補(bǔ)配對，誘導(dǎo)對mRNA的切割降解，而部分堿基配對則導(dǎo)致功能蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄抑制［1］。最近有文章報道m(xù)iRNAs與腫瘤的關(guān)系，特別是與腫瘤惡性度及腫瘤患者的預(yù)后有密切關(guān)系［2］。亦有報道與正常組織比較，惡性腫瘤組織的miRNAs異常表達(dá)［3］。一些miRNAs具有致瘤性，而另一些則具有抑制腫瘤發(fā)生的特性。致瘤性miRNAs在癌癥中高表達(dá)，通過靶向腫瘤抑制基因等各種機(jī)制促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。相反，一些具有抑制腫瘤特性的miRNAs在癌癥中低表達(dá)［4，5］。我們前期研究結(jié)果顯示 miR-34c在膠質(zhì)瘤組織中廣泛表現(xiàn)為低表達(dá)，且隨膠質(zhì)瘤級別的升高，miR-34c-3p和miR-34c-5p的表達(dá)顯著降低，miR-34c-3p和miR-34c-5p的表達(dá)與膠質(zhì)瘤的級別存在顯著負(fù)相關(guān)。本研究采用給膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251和U87細(xì)胞轉(zhuǎn)染 miR-34c-3p和 miR-34c-5p，上調(diào)其表達(dá)，檢測miR-34c對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲的影響，旨在為膠質(zhì)瘤的治療開拓新的思路。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞株 膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251和U87細(xì)胞購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。正常人膠質(zhì)細(xì)胞系HEB購自中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):U251用含10%FBS的 DMEM-F12培養(yǎng)基，U87和HEB用含10%FBS的DMEM-高糖培養(yǎng)基，將符合細(xì)胞計數(shù)要求的細(xì)胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶內(nèi)，將培養(yǎng)瓶放入37℃和5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)24～48 h后換液繼續(xù)培養(yǎng)，換液的時間由細(xì)胞貼壁情況而定。培養(yǎng)U251、U87、HEB細(xì)胞達(dá)到指數(shù)生長期進(jìn)行實驗。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染microRNA:轉(zhuǎn)染采用LipofectamineTMRNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑，用LipofectamineTMRNAiMAX轉(zhuǎn)染microRNA(mimics濃度為50 nmol/L)到細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)染時使用Opti-MEM培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染后4 h換為細(xì)胞生長培養(yǎng)基(U251用含10%FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基，U87和HEB用含10%FBS的DMEM-高糖培養(yǎng)基)。

1.2.3 定量PCR檢測轉(zhuǎn)染效果:利用 Trizol(Invitrogen，USA)提取收集細(xì)胞總RNA。取1 μg總RNA做stem-loop引物的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。miR-34c-3p和miR-34c-5p的共同逆轉(zhuǎn)錄引物為:miRNA R:5’CTCAACTGGTGTCGTGGA;PCR引物為:hsa-miR-34c-3p F:5’ACACTCCA GCTGGGAATCACTAACCACACGG;hsamiR-34c-5pF:5’ACACTCCAGCTGGGAGGCAGTGTAGTTAGCTGAT;內(nèi)參 U6的引物為:U6-F:5’CTC GCTTCGGCAGCACA;U6-R:5’AACGCTTCACGAATTTGCGT。所有引物均為上海生工合成。使用的定量PCR儀為ABI PRISM?7500 Sequence Detection System。PCR擴(kuò)增程序如下:95℃變形5 min，隨后95℃作用 15 s，65℃作用 15 s，72℃ 作用32 s，共進(jìn)行 40 個循環(huán)，在溫度60℃ ～95℃進(jìn)行融解曲線分析，每個樣本重復(fù)3次。

1.2.4 Transwell檢測細(xì)胞遷移能力:細(xì)胞轉(zhuǎn)染 miRNA第2天，計數(shù)1×105個細(xì)胞，用100 ml無血清培養(yǎng)基重懸(U251用DMEM-F12，U87用MEM培養(yǎng)基)，加入Transwell小室上室，在下室加入600 ml完全培養(yǎng)基。在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24、48 h，分別取出小室，用棉簽擦去上室的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌3次，結(jié)晶紫染色10 min，PBS洗滌3次，檢測細(xì)胞是否穿過小孔，如有穿過終止其他實驗組，在高倍鏡下(×400)隨機(jī)取5個視野計數(shù)，并拍照統(tǒng)計。重復(fù)實驗2次。

1.2.5 Transwell檢測細(xì)胞侵襲能力:4℃溶解Matrigel凝膠過夜，用預(yù)冷的無血清培養(yǎng)基(U251用DMEMF12，U87用DMEM高糖培養(yǎng)基)以1∶3的體積比稀釋Matrigel凝膠，取40 ml加入預(yù)冷的Transwell板上室，覆蓋整個聚碳脂膜，37℃孵育2 h使Matrigel凝膠凝固。細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA第2天，吸走小室中多余的液體，Transwell培養(yǎng)板上室加入100 μl細(xì)胞懸液(5×104個)并加入無血清培養(yǎng)基200 ml。Transwell培養(yǎng)板下室加入500 μl趨化因子，37℃，5%CO2培養(yǎng)24 h。用濕棉簽輕輕擦去Matrigel凝膠和聚碳酯膜上表面的細(xì)胞。小心取出上室，用線拴住，并做好標(biāo)記，用預(yù)冷的甲醇固定30 min。蘇木素染色1 min。梯度乙醇脫水(80%，95%，100%)，二甲苯透明。小心將聚碳酯膜自上室基底切取下來，置載玻片上中性樹脂封片。附著于聚碳酯膜下表面的細(xì)胞在高倍鏡下(×400)隨機(jī)取4個視野計數(shù)，取平均數(shù)。重復(fù)實驗2次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，選用單因素χ2分析，如方差不齊采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 定量PCR檢測miR-34c-3p和 miR-34c-5p的轉(zhuǎn)染效果 在 U87和 U251細(xì)胞系中，miR-34c-3p和miR-34c-5p的表達(dá)量要明顯小于正常膠質(zhì)細(xì)胞系HEB。而轉(zhuǎn)染了miR-34c-3p的U87和U251細(xì)胞，其miR-34c-3p的表達(dá)量明顯高于未轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞(Normal組，P＜0.05)和NC 組細(xì)胞(P＜0.05)，miR-34c-5p也呈同樣的變化。該結(jié)果確定了miRNA確實轉(zhuǎn)染成功。見圖1、2。

圖1 轉(zhuǎn)染miRNA-34c-3p前后，實時定量PCR檢測正常膠質(zhì)細(xì)胞系HEB、U251和U87細(xì)胞系中miRNA-34c-3p的表達(dá);與 HEB比較，*P ＜0.05;與 Normal比較，#P ＜0.05;與 NC 組比較，△P ＜0.05

圖2 轉(zhuǎn)染miRNA-34c-5p前后，實時定量PCR檢測正常膠質(zhì)細(xì)胞系HEB、U251和U87細(xì)胞系中miRNA-34c-3p的表達(dá);與 HEB比較，*P ＜0.05;與 Normal比較，#P ＜0.05;與 NC 組比較，△P ＜0.05

2.2 轉(zhuǎn)染miRNA-34c抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移能力利用 Transwell小室，U251細(xì)胞轉(zhuǎn)染 miR-34c-3p或miR-34c-5p后，其遷移至下室的細(xì)胞數(shù)量與Normal組和NC組相比顯著減少，在U87細(xì)胞中的情況相同。見圖 3、4。

圖3 轉(zhuǎn)染miRNA-34c-3p或miR-34c-5p后，U251細(xì)胞的遷移情況;與Normal組比較，*P ＜0.05;與 NC 組比較，#P ＜0.05

圖4 轉(zhuǎn)染miRNA-34c-3p或miR-34c-5p后，U87細(xì)胞的遷移情況;與Normal組比較，*P ＜0.05;與 NC 組比較，#P ＜0.05

2.3 轉(zhuǎn)染miRNA-34c抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力

利用 Transwell小室，U251細(xì)胞轉(zhuǎn)染 miR-34c-3p或miR-34c-5p后，其侵襲至聚碳酯膜下表面的細(xì)胞數(shù)與Normal組和NC組相比顯著減少，在U87細(xì)胞中的情況相同。該實驗證實了miR-34c高表達(dá)能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力。見圖5、6。

圖5 轉(zhuǎn)染miRNA-34c-3p或miR-34c-5p后，U251細(xì)胞的侵襲情況;與Normal組比較，*P ＜0.05;與 NC 組比較，#P ＜0.05

圖6 轉(zhuǎn)染miRNA-34c-3p或miR-34c-5p后，U87細(xì)胞的侵襲情況;與Normal組比較，*P ＜0.05;與 NC 組比較，#P ＜0.05

3 討論

腫瘤的發(fā)生是細(xì)胞增殖、凋亡和分化失衡的結(jié)果。越來越多的研究證實許多miRNA具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和存活的作用，同時還有許多miRNA具有抑制細(xì)胞增殖和存活的作用，這兩類miRNA作為癌基因和抑癌基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中各自發(fā)揮著重要的作用。許多研究也說明將miRNA作為腫瘤治療的靶標(biāo)是可行的。在近期的研究中，miR-34異常表達(dá)抑制分化、克隆形成和細(xì)胞周期在 G1 期阻滯［6，7］。并且，miR-34a的再表達(dá)誘導(dǎo)了細(xì)胞的凋亡［8］。有證據(jù)表明miR-34介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡能夠被p53基因的失活所抑制。有報道 miR-34a靶向一些 mRNA，例如 SIRT1、Bcl-2、N-myc、cyclin D1，導(dǎo)致這些基因轉(zhuǎn)錄受到抑制［6，9，10］。

惡性膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)常見的腫瘤。通過前期的研究我們發(fā)現(xiàn)，與正常腦組織比較，miR-34c在人類惡性膠質(zhì)瘤組織和多種細(xì)胞系中呈低表達(dá)。在本研究中，我們利用多種細(xì)胞生物學(xué)方法，進(jìn)一步探討miR-34c對膠質(zhì)瘤U87和U251細(xì)胞系的生物學(xué)功能，以便為膠質(zhì)瘤的治療尋找新的靶標(biāo)。我們利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法，將化學(xué)合成的miR-34c寡核苷酸轉(zhuǎn)染到膠質(zhì)瘤U87和U251細(xì)胞中，同時設(shè)立轉(zhuǎn)染非特異性寡核苷酸片段的陰性對照組，使miR-34c基因有效的過表達(dá)。

本實驗首先檢測轉(zhuǎn)基因細(xì)胞對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移的影響。利用Transwell細(xì)胞遷移實驗對細(xì)胞進(jìn)行檢測。我們發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染了miR-34c-3p或miR-34c-5p的細(xì)胞遷移能力明顯減弱。我們進(jìn)一步利用Transwell方法檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲能力，證實了miR-34c高表達(dá)能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力。

從體外實驗數(shù)據(jù)看來，miR-34c-3p和miR-34c-5p能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲，我們可以大膽推測miR-34c-3p和miR-34c-5p在膠質(zhì)瘤中扮演抑癌的角色，但miR-34c-3p與miR-34c-5p是通過調(diào)控哪些基因起作用，目前還不明了，有待于在以后的實驗中繼續(xù)探討。

1 Nelson KM，Weiss GJ.MicroRNAs and cancer:past，present，and potential future.Molecular cancer therapeutics，2008，7:3655-3660.

2 Gao H，Zhao H，Xiang W.Expression level of human miR-34a correlates with glioma grade and prognosis.Journal of neuro-oncology，2013，113:221-228.

3 Croce CM.Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer.Nature reviews.Genetics，2009，10:704-714.

4 Deng S，Calin GA，Croce CM，et al.Mechanisms of microRNA deregulation in human cancer.Cell Cycle，2008，7:2643-2646.

5 Medina PP，Slack FJ.microRNAs and cancer:an overview.Cell Cycle，2008，7:2485-2492.

6 Bommer GT，Gerin I，F(xiàn)eng Y，et al.p53-mediated activation of miRNA34 candidate tumor-suppressor genes.Current biology，2007，17:1298-1307.

7 Tarasov V，Jung P，Verdoodt B，et al.Differential regulation of microRNAs by p53 revealed by massively parallel sequencing:miR-34a is a p53 target that induces apoptosis and G1-arrest.Cell Cycle，2007，6:1586-1593.

8 Hermeking H.The miR-34 family in cancer and apoptosis.Cell death and differentiation，2010，17:193-199.

9 Yamakuchi M，F(xiàn)erlito M，Lowenstein CJ.miR-34a repression of SIRT1 regulates apoptosis.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2008，105:13421-13426.

10 Christoffersen NR，Shalgi R，F(xiàn)rankel LB，et al.p53-independent upregulation of miR-34a during oncogene-induced senescence represses MYC.Cell death and differentiation，2010，17:236-245.