HDAC1及E2F1在腎透明細胞癌中的表達及意義

朱鑫 王亞軒 常學良 韓振偉 滕志海 王志勝 高栩 郭紹衛 李景東 黎瑋

腎細胞癌(renal cell carcinoma，RCC)，是泌尿生殖系統中常見的惡性腫瘤，其發病率僅次于膀胱癌，腎透明細胞癌為腎癌中最為常見的病理類型，約占RCC 80%左右，近年來其發病率有上升的趨勢［1］。因此，本研究以腎透明細胞癌患者為研究對象，通過觀察組蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)及轉錄因子E2F1的表達，探討二者與腎透明細胞癌臨床病理特征的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2013年7月至2014年7月我科住院手術患者的腎透明細胞癌標本51例(經病理證實均為腎透明細胞癌)，同時選取24例癌旁組織(遠離癌組織5 cm以上，均經病理證實為正常腎組織)。組織學分級按照WHO 1997年推薦的Fuhrman三級分類標準，臨床分期按照2010年美國抗癌協會(AJCC)RCC的TNM分期標準。所有病例術前均未進行放療、化療和免疫治療。所有標本分為兩份，一份經10%甲醛溶液固定，常規石蠟塊包埋、切片;另一份標本術后立即以液氮快速冷凍并保存于－80℃冰箱中備用。

1.2 實驗試劑 兔HDAC1單克隆抗體及鼠E2F1單克隆抗體均購自于美國Santa Cruz生物技術公司，瓊脂糖購自于西班牙公司，PCR反應體系、cDNA Synthesis Kit、RNAiso Plus、DL2000 DNA Marker均購自于日本Takara公司，ABC免疫組化試劑盒購自于美國Vector Laboratories公司。設立 GAPDH基因片段為HDAC1和E2F1基因表達的內參照;HDAC1基因上游引物:5＇-TGCAAAGAAGTCCGAGGCAT-3＇，下游引物:5＇-TGGCCTCATAGGACTCGTCA-3＇。E2F1 上 游 引 物:5 ＇-CTACGTGACGTGTCAGGACC-3 ＇，下 游 引 物:5 ＇-GGTGGGGAAAGGCTGATGAA-3 ＇。GAPDH 上 游 引 物:5 ＇-GACCACAGTCCATGCCATCA-3＇，下游引物:5＇-GAGATTCAGTGTGGTGGGGG-3＇。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學方法:采用免疫組織化學方法檢測腎透明細胞癌組織、癌旁正常腎組織中HDAC1及E2F1的蛋白表達，實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3.2 RT-PCR 方法:用 Trizol加入 RNAiso Plus的溶液中提取組織總RNA，紫外分光光度計260、280和320 nm處讀取OD值，然后測定RNA的純度及含量。逆轉錄反應依照cDNA合成試劑盒說明書操作。將逆轉錄產物在基因擴增儀中進行PCR反應。將擴增產物放于含GV核酸染料的瓊脂糖凝膠電泳，以DNA Marker(DL2000)作為標準片段標記，電泳后經紫外透射儀觀察、數碼相機照相以及采用Quantity One凝膠圖象分析軟件對目的電泳條帶分析后，以相應的內參電泳條帶作為參照，最后采用兩者積分吸光度比值表示結果。

1.3.3 結果評定:免疫組化結果判定方法:采用雙評分半定量法進行評分，每張切片在高倍鏡下隨機觀察10個視野(400倍)，每個視野均計數100個細胞，計算其平均陽性細胞百分比:無陽性細胞為0分;≤10%為1分;11% ～50%為2分;51% ～75%為2分;＞75%為4分。計數陽性細胞數染色強度分數標準:細胞未著色為0分;淡黃色為1分;黃色或淡棕黃色為2分;棕黃色為3分。將染色強度記分與染色細胞百分數計分相乘:0～3分為陰性表達;4～12分為陽性表達。

1.4 統計學分析 應用SPSS 19.0統計軟件，計量資料以±s表示，采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗或Fisher確切概率法檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組織化學染色結果顯示 HDAC1及E2F1的蛋白陽性表達均出現在細胞核。HDAC1蛋白在腎透明細胞癌組織中的陽性表達率為62.7%(32/51)，高于癌旁正常組織中的25%(6/24)(P＜0.05);E2F1蛋白在腎透明細胞癌組織中的陽性表達率為70.6%(36/51)，高于癌旁正常腎組織中的37.5%(9/24)(P＜0.05);HDAC1與E2F1的蛋白表達與患者性別、年齡及瘤體大小無關(P＞0.05);組織學分級及臨床分期越高，蛋白表達陽性率越高(P＜0.05)。見表1、2，圖1 ～4。

表1 腎癌、癌旁組織中HDAC1及E2F1的蛋白表達 例

表2 HDAC1及E2F1的蛋白表達與臨床病理特征的關系

圖1 癌旁正常組織中HDAC1的表達(IHC，SP×400)

圖2 腎癌組織中HDAC1的表達(IHC，SP×400)

圖3 癌旁正常組織中E2F1的表達(IHC，SP×400)

圖4 腎癌組織中E2F1的表達(IHC，SP×400)

2.2 RT-PCR結果顯示 HDAC1mRNA在腎透明細胞癌組織中的相對表達量為(0.35±0.15)，高于癌旁正常腎組織(0.10 ±0.04)(P＜0.05);E2F1mRNA 在腎透明細胞癌組織中的相對表達量為(0.32±0.09)，高于癌旁正常腎組織(0.14 ±0.03)(P＜0.05);HDAC1與E2F1 mRNA的相對表達量與患者性別、年齡及瘤體大小無關(P＞0.05);組織學分級及臨床分期越高，mRNA相對表達量越高(P＜0.05)。見表3、4，圖5。

表3 腎癌、癌旁組織中HDAC1及E2F1的mRNA相對表達量±s

表3 腎癌、癌旁組織中HDAC1及E2F1的mRNA相對表達量±s

類別 HDAC1 mRNA相對表達量 P值 E2F1 mRNA相對表達量 P值腎癌(n=51)0.35 ±0.15 0.000 0.32 ±0.09 0.004癌旁(n=24)0.10 ±0.04 0.000 0.14 ±0.03 0.004

表4 HDAC1及E2F1的mRNA相對表達量與臨床病理特征的關系±s

表4 HDAC1及E2F1的mRNA相對表達量與臨床病理特征的關系±s

組別 HDAC1 mRNA相對表達量 P值 E2F1 mRNA相對表達量 P值性別男(n=17) 0.379 ±0.036 0.539 0.305 ±0.055 0.283女(n=14) 0.333 ±0.068 0.539 0.327 ±0.038 0.283年齡(歲)＜60(n=13) 0.326 ±0.075 0.712 0.298 ±0.056 0.114≥60(n=18) 0.385 ±0.027 0.712 0.325 ±0.023 0.114瘤體大小(cm)≤7(n=19) 0.367 ±0.049 0.443 0.311 ±0.008 0.822＞7(n=12) 0.344 ±0.053 0.443 0.328 ±0.004 0.822組織學分級高、中分化(n=20)0.315 ±0.082 0.000 0.249 ±0.097 0.015低/未分化(n=11) 0.404 ±0.010 0.000 0.391 ±0.007 0.015臨床分期Ⅰ +Ⅱ期(n=16) 0.299 ±0.083 0.012 0.278 ±0.094 0.008Ⅲ+Ⅳ期(n=15)0.395 ±0.002 0.012 0.359 ±0.015 0.008

圖5 為HDAC1及E2F1在不同組織中mRNA的相對表達量(癌旁正常組織:1～6;腎癌組織:7～13)

3 討論

腎透明細胞癌是泌尿生殖系統中常見的惡性腫瘤，嚴重威脅患者的生命健康。因此，深入探討腎透明細胞癌發生發展的相關因素及分子機制，尋找新的分子生物學指標，為腎透明細胞癌的早期診治尋找有效的診斷指標和治療靶點。

HDAC1是Ⅰ類組蛋白去乙酰化酶HDACs家族成員，其與組蛋白乙酰化酶(HATs)的共同催化，形成可逆的動態修飾過程，共同控制染色質中核心組蛋白的乙酰化水平;組蛋白的乙酰化程度與轉錄活性的發揮有密切關系。HDACs可以乙酰化不同種類的細胞轉錄因子或蛋白，影響多種抑癌蛋白或癌基因的表達，導致細胞的惡性增殖和腫瘤的發生［2］。目前發現HDAC1在前列腺癌、胃癌、結腸癌組織中高表達［3－5］。HDAC1與許多實體瘤的侵襲性及進展有密切關系，但在ccRCC中的表達報道甚少，Fritzsche等［6］研究了106例RCC及腫瘤旁組織中的HDAC1、2和3的表達，研究結果顯示 60%的 RCC表達 HDAC1、2，而HDAC3只有13%的表達。Silvia等［7］研究發現人腫瘤細胞缺失HDAC1不能進行有效的有絲分裂，進而誘導細胞凋亡，細胞周期停滯在G1期或G2/M過渡期，從而抑制了腫瘤細胞的生長。

E2F1是細胞內一個重要的轉錄激活因子，參與細胞周期及細胞凋亡等眾多的細胞活動調控過程，且與腫瘤的發生發展有密切關系。Xie等［8］的研究結果顯示，利用E2F1質粒過表達后，胃癌細胞發生了細胞周期停滯現象，增殖抑制，凋亡增加，癌細胞侵襲能力受到抑制，提示E2F1抑制胃癌的發生發展，表明E2F1有抑癌的功能。而Yamasaki等［9］研究發現，E2F1基因缺失的Rb(+/－)小鼠的腦垂體和甲狀腺腫瘤的發生率下降，提示E2F1又具有癌基因的功能。總之，轉錄因子E2F1在腫瘤發生發展中的促癌及抑癌作用至今沒有統一及完整的闡述;但已經可以明確的是絕大多數腫瘤都存在基因突變或遺傳修飾異常，最終導致E2F1的失活或活性加強。

本實驗中，利用免疫組織化學法和RT-PCR法檢測HDAC1及E2F1在蛋白及分子水平的表達，數據顯示HDAC1與E2F1在腎透明細胞癌中的表達高于癌旁正常組織，且與組織學分級及臨床分期有關，并隨組織惡性程度的增加其表達水平逐漸增加，提示與腎透明細胞癌的進展有密切關系。通過檢測HDAC1和E2F1在ccRCC中的表達可能對預測ccRCC的生物學行為以及早期診斷、制定治療方案等方面有指導性的臨床意義，并可能成為潛在的治療靶點。但本實驗也存在一些不足:(1)在細胞非分裂期的腫瘤細胞里抑制E2F1的活性發揮及表達，而進入分裂期，E2F1轉錄活性大大提高，促進惡性增殖，誘導腫瘤形成，而非分裂期與分裂期在臨床實驗中很難鑒定。(2)本實驗未能進一步研究體外細胞株轉染和進行動物模型實驗，實驗周期較短未能隨訪患者的遠期預后情況，因此下一步需要增加這幾方面的實驗研究以完善本實驗，并隨訪本研究中腎透明細胞癌患者的預后情況，分析HDCA1及E2F1的表達與患者預后的關系，進而明確HDCA1及E2F1能否用于對腎透明細胞癌患者預后的評估。

1 吳階平主編.吳階平泌尿外科學.第1版.濟南:山東科學技術出版社，2008.889-912.

2 Cress WD，Seto E.Histone deacetylases，transcriptional control，and cancer.J Cell Physiol，2000，184:1-16.

3 Choi JH，Kwon HJ，Yoon BI，et al.Expression profile of histone deacetylase in gastric cancer tissues.Jpn J Cancer Res，2001，92:1300-1304.

4 Halkidou K，Gaughan L，Cook S，et al.Upregulation and nuclear recruitment of HDAC1 in hormone refractory prostate cancer.Prostate，2004，59:177-89.

5 Patra SK，Patra A，Dahiya R.Histone deacetylase and DNA methyltransferase in human prostate cancer.Biochem Biophys Res Commun，2001，287:705-713.

6 Fritzsche FR，Weichert W，Rske A，et al.Histone deacetylases 1，2 and 3 are highly expressed in prostate cancer.Br J Cancer，2008，98:604-610.

7 Silvia S，Katrin Z，Simone M，et al.Role for histone deacetylase 1 in human tumor cell proliferation.Mol Cell Biol，2007，27:4784-4795.

8 Xie Y，Wang C，Li L，et al.Overexpression of E2F-1 inhibits progression of gastric cancer in vitro.Cell Biol Int，2009，33:640-649.

9 Yamasaki L，Bronson R，Williams BO，et al.Loss of E2F-1 reduces tumorigenesis and extends the lifespan of Rb1(+/－ )mice.Nat Genet，1998，18:360-364.