基于綠色熒光蛋白瞬時表達的植物亞細胞定位方法

于一帆　朱小彬　葛會敏　陳云

摘要：細胞是生命活動的基本單位，各種蛋白質都按照其功能有序地分布在細胞的每個分區中。蛋白質的亞細胞定位是功能基因組學的重要內容。目前植物蛋白質的亞細胞定位方法中應用較普遍的是借助于報告基因表達產物來實現目標蛋白定位的融合報告基因定位法，其中綠色熒光蛋白應用最為廣泛。綜述了基于綠色熒光蛋白瞬時表達的植物亞細胞定位方法，包括擬南芥原生質體瞬時表達、煙草葉片瞬時表達、洋蔥表皮細胞瞬時表達等，同時對上述幾種方法進行了比較分析。

關鍵詞：蛋白質；亞細胞定位；綠色熒光蛋白；瞬時表達

中圖分類號： Q-33文獻標志碼： A

文章編號：002-302（204）2-0058-04

蛋白質是生物功能的直接體現者，有序分布、動態調控的蛋白質是保證生命個體正常生長發育的前提。基因表達產物在組織中的亞細胞定位是功能基因組學、蛋白質組學的重要研究內容之一，是系統理解植物形態建成、生長發育以及對逆境的耐受性、抵抗性不可或缺的環節，也是生物學家們初步推斷蛋白質生物學功能的重要依據。蛋白質的亞細胞定位可采取多種方法，包括生物信息學預測、免疫膠體金標記[2]、多肽序列分析[3]以及與報告基因融合瞬時表達[4]等。目前植物蛋白的亞細胞定位應用主要是借助于融合報告基因定位法，其中綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GF）應用最為廣泛。瞬時表達技術結合報告基因，可以有效跟蹤融合產物在細胞內的運輸、亞細胞定位及代謝[5]。GF是水母（Aequorea victoria）體內的天然蛋白，自994年Chalfie等揭示了該蛋白作為報告蛋白的潛在應用價值[6]以來，已作為報告蛋白在多種植物、動物、微生物中成功獲得表達。由于GF作為報告蛋白不需抗體、輔助因子、酶底物等其他成分，也不影響宿主細胞，因而可以鑒定、跟蹤、分選表達GF的細胞；同時可以在活細胞中進行圖像分析，在固定細胞中進行檢測[7]。瞬時表達（transient expression）是指引入細胞的外源DNA與宿主細胞染色體DNA并不發生整合，而是隨載體進入細胞，約2 h左右可表達，基因產物在2～4 d內即可被檢測出，是種快速研究基因表達、蛋白質亞細胞定位及基因間互作的重要手段。瞬時表達能表達多種外源基因，具有時間短、重復性好等優點，彌補了常規轉基因方式中周期長、轉化效率低等缺點[8]。與傳統的轉基因相比，瞬時表達不需要整合到染色體上，因此具有簡單、快速、周期短、準確等優點[9]。瞬時表達不受基因位置效應、基因沉默的影響，表達效率較穩定，轉化率高。目前，植物瞬時表達系統已被陸續應用到生物學研究中，如利用該系統進行基因功能的鑒定分析、發現新型強啟動子、蛋白質互作、亞細胞定位等。亞細胞定位瞬時表達的宿主載體主要有擬南芥原生質體、煙草葉片、洋蔥表皮細胞等。本研究對常用的基于綠色熒光蛋白瞬時表達的植物蛋白質亞細胞定位方法進行總結，并對相關研究進行展望，以期更高效地進行植物蛋白質的亞細胞定位。

擬南芥原生質體瞬時表達

擬南芥瞬時表達系統由en Sheen教授實驗室建立并完善[0]。該方法在蛋白定位、啟動子研究以及蛋白質相互作用等方面很有效。擬南芥（Arabidopsis thaliana）是種模式植物，一直以來，擬南芥原生質體都是植物基因工程、植物細胞學研究的經典材料。原生質體作為種細胞水平的研究系統，由于沒有細胞壁等特點，它可以排除細胞之間的相互影響，單獨考察個細胞的全能性。原生質體是個均一性程度很好的群體，并且在短時間內就能獲得大量原生質體。原生質體是個理想的試驗系統，由于不受植物細胞壁的限制，其質膜經一定處理可以攝取外源物質（如細胞器、病毒、DNA等），是遺傳轉化的理想受體系統。研究表明，不同植物材料所得到的原生質體可以保持原組織的生理生化特性，可以取代植物組織作為理想的試驗材料。

EG-Ca2 介導轉化法

聚乙二醇（EG）作為種高分子化合物，20%～50%的濃度能對原生質體產生瞬間沖擊效應，使原生質體很快發生收縮。EG也能連接Ca2等陽離子，Ca2可在帶負電荷的質粒DNA、EG之間形成橋，從而促使質粒進入原生質體。EG-Ca2介導的轉化是擬南芥瞬時表達體系最常用的方法。該方法的技術流程是：擬南芥土培3～4周，生長過程中要求光周期較短（～2 h）。用解剖刀將符合要求的葉片切成細小的小段，溶于5 mL酶液中（纖維素酶0225 g，離析酶02 5 g，甘露醇64 g，pH值為57的MES 5 mL，55 ℃ 0 min，冷卻至室溫，再加入 mol/L CaCl2 5 μL、β-巰基乙醇525 μL、牛血清白蛋白BSA 50 μL，加dd H2O至5 mL）。避光抽真空 h，40 r/min慢搖4 h，然后80 r/min 搖5 min使小片段完全酶解。用等體積W5溶液（09% NaCl、0% CaCl2、0037% KCl、2% pH值為57的 MES）稀釋，過2層300目細胞篩，用W5溶液補體積至40～50 mL，00 g平甩離心5 min。棄上清后，用0 mL W5溶液輕柔清洗原生質體。用 mL Mmg溶液（093% 甘露醇、0304% MgCl2、4% MES）重懸原生質體。00 μL原生質體加0 μg質粒，然后加入等體積EG/Ca2 溶液（9% 甘露醇、0% CaCl2、40% EG 4000），緩慢輕柔混勻，25 ℃暗培養0～5 min。逐滴加入440 μL W5溶液。加 mL WI溶液（093% 甘露醇、4% MES、003% KCl）重懸，槍頭輕打混勻。鏡檢計數后置于培養板25 ℃過夜培養，使用熒光倒置顯微鏡觀察熒光[2]。

2電擊穿孔法

在適宜的高壓電脈沖作用下，原生質體細胞膜形成可修復的微孔，親水性物質通過這些微孔進入細胞。Langridge等采用電擊技術分別把Ti質粒、CAT基因等導入胡蘿卜原生質體并獲得瞬間表達[3-4]。此后，在煙草、油菜、大豆、水稻、小麥、高粱、玉米等植物中都實現了原生質體的電擊基因轉移及其表達。就操作而言，電擊法技術簡單方便。但是影響電擊基因導入、表達的因素卻是相當復雜的[5]。

3脂質體介導轉化法

脂質體介導轉化法是將質粒DNA包裹在脂質體中，然后與原生質體接觸融合而把外源DNA帶入原生質體的種方法。脂質體是種由磷脂、膽固醇、脂肪酸等脂類分子組成的球形膜囊結構，可將DNA、RNA等大分子物質包在脂質體內，免受細胞內核酸酶的降解。脂質體可做成單層、雙層或多層。脂質體進入原生質體主要發生在脂質體與原生質體共培養的起始2 h，共培養90 min后，加入一定濃度的EG能提高脂質體、原生質體融合的頻率。

4植物病毒載體介導法

植物病毒大多為RNA，病毒載體介導的外源基因瞬時表達系統原理是將目的基因克隆到植物病毒基因組載體上的啟動子下游，通過體外轉錄后的直接侵染，或借助基因槍、農桿菌等將其導入植物細胞。病毒在植物細胞間移動可以確保其進入較大范圍甚至是整株細胞中，方便在植株整體水平開展外源基因功能研究。病毒在植物細胞內的大量復制，使外源基因的表達量獲得顯著提高，而且外源基因與病毒外殼蛋白的融合可以將外源基因產物展示在病毒顆粒表面，易于提取、分析[6]。植物病毒載體介導法的缺點是盡管植物種類繁多，且一些病毒可以侵染的宿主細胞范圍很寬，但是目前成功開發為轉化載體的病毒還很少，一些重要的作物類型還無法使用病毒侵染；病毒載體所能插入的外源片段較小，且病毒重組可能會影響表達產物的穩定。

5其他轉化方法

[3]其他遺傳轉化技術如激光微素法[7]、顯微注射法[8]、超聲波法[9]等也正被逐步應用到植物原生質體的遺傳轉化上來。

2煙草葉片瞬時表達

煙草生長周期短、轉基因技術成熟，且轉基因過程簡單易操作，常被用做試驗材料進行外源功能基因的亞細胞定位，加快了功能基因的研究進程。將定位載體導入農桿菌，利用注射法在煙草表皮細胞實現蛋白的亞細胞定位[20-22]，使基因功能研究更加經濟快捷。在煙草細胞或組織中瞬時表達外源基因，當農桿菌細胞滲透至葉片的細胞間隙時，可以高效率地將T-DNA導入植物細胞核內，達到表達外源基因并分析外源基因功能的目的[5]。采用在煙草葉片中表達外源基因的方法，最大的優點是簡便快捷，且容易操作，但是表達外源基因的效率要低于轉基因等方法[23]。

2注射法

采用注射器直接將農桿菌注射至葉片下表皮細胞間隙方法的技術流程是：煙草植株2 ℃土培5～6周，光周期為 4 h/d。[2]挑取農桿菌單菌落于4 mL YEB培養基中，28 ℃ 200 r/min 過夜培養。吸取～5 mL菌液置于50 mL YEB培養基中，28 ℃繼續培養8 h。室溫下2 200 g離心0 min。棄上清，用50 mL滲透液（250 mg D-葡萄糖、5 mL 50 mmol/L MES、5 mL 2 mmol/L Na3O4·2H2O、5 μL mol/L 乙酰丁香酮）重懸至D600 nm為0，室溫放置至少3 h。用無菌 mL醫用注射器吸取菌液，將針頭刺入下表皮，輕輕將菌液注射進下表皮空隙中。煙草注射菌液后繼續在22～24 ℃下培養，36 h 后進行熒光檢測[24-25]。

22浸染法

將含有重組質粒的農桿菌單菌落培養至D600 nm為0，煙草嫩葉用HgCl2溶液消毒后剪成小塊或打孔，浸入菌液3～5 min，均勻搖晃，置于固體MS培養基表面，暗培養24～72 h，撕表皮，用熒光倒置顯微鏡觀察熒光[26]。

3洋蔥表皮細胞瞬時表達

洋蔥表皮細胞結構清晰，取材方便，是觀察細胞部分功能、外源基因瞬時表達的好材料。洋蔥表皮細胞中瞬時表達外源基因的方法主要有農桿菌介導法、基因槍轟擊法2種。

3農桿菌介導法

農桿菌介導的植物遺傳轉化系統作為種天然的植物基因轉化系統，已經成為當今植物遺傳轉化的主流方法[27]。農桿菌介導的瞬時表達快速有效，其原理是將目的基因插入載體，轉化到農桿菌中，采用真空滲透或注射等方法使農桿菌與植物材料細胞接觸，大部分T-DNA進入細胞核內進行瞬時表達，幾天后即可檢測到外源基因的表達[28]。農桿菌滲入法的技術流程包括載體構建、農桿菌培養、針管注射浸潤、瞬時表達等部分。針對洋蔥表皮細胞的農桿菌介導方法主要是先將含重組質粒的農桿菌單菌落培養至D600 nm為06，2 800 g離心0 min，棄上清，用MS（0 mmol/L MgCl2、00 μmol/L乙酰丁香酮）重懸菌液。取洋蔥球莖內4～7層表皮滅菌，撕 cm2 內表皮置于農桿菌液中20 min，將內表皮平鋪于MS固體培養基上暗培養6 h。用熒光倒置顯微鏡觀察熒光[29]。

32基因槍轟擊法

[2]基因槍法（gene gun）介導的瞬時表達應用較早，技術也較成熟。基因槍法原理是利用高速飛行的微米或亞微米級惰性粒子（鎢或金粉），將包被其外的目的基因直接導入受體細胞，并釋放出外源DNA，使DNA在受體細胞中獲得短暫的高水平表達，從而實現對受體細胞的瞬時轉化。目前，基因槍轉化包括鎢粉準備、DNA包裹鎢粉微粒以及基因槍轟擊等步驟[30-3]。

4討論

目前，上述幾種方法常被用于植物蛋白質亞細胞定位瞬時表達研究。筆者對這幾種方法分別進行比較、總結，并對各種方法的不足之處提出改進。

4以擬南芥為宿主載體

擬南芥作為模式植物，在生物學研究中十分重要。利用擬南芥進行原生質體相關研究，能夠克服植物細胞工程領域的許多困難。原生質體細胞作為遺傳轉化的理想受體，可用于轉入基因的表達定位、功能分析等研究。除了可以攝取核酸大分子外，原生質體還可以吞噬或融合細胞器以及細菌、病毒等微生物，這有可能開辟植物細胞工程研究的新領域[32]。然而該系統也有不足的地方：一方面是植物細胞壁被酶解掉了，因此不適合研究外膜蛋白，更無法研究細胞壁；另一方面，原生質體本身存活時間一般不超過72 h，不能連續培養，因此不能進行長期觀察，也不能用來研究與細胞周期有關的問題。應用最廣泛的EG-Ca2 介導轉化法的不足之處也是很明顯的。首先，用于提取原生質體的擬南芥葉片只能選取符合要求的，且葉片需要切成 mm條狀，因此要求操作技巧較高。另外還需要長時間的抽真空、搖床慢搖等，耗時長。針對這些問題，前人提出的借助膠帶提取原生質體的方法顯然更為高效，該方法對葉片的選擇沒有任何限制，而且無需對葉片進行切割，無需抽真空處理，水平慢搖也僅需20～60 min，相比上述方法省略了大量操作，節約了時間，葉片表皮也能較好地剝離，提取原生質體的效率更高。

42以煙草為宿主載體

采用在煙草葉片中表達外源基因的方法最大的優點是簡便快捷，不需要酶解制備原生質體，但是表達外源基因的效率遠遠低于轉基因等方法。煙草葉盤較大，注射時操作簡單，目的基因與對照組可在同一張葉片上進行試驗，可以更好地控制變量，但是受侵染液濃度、侵染時間影響較大。傳統的注射法中，注射煙草葉片都是撕取煙草葉片的下表皮，制成臨時裝片置于熒光倒置顯微鏡下觀察。然而撕取煙草葉片下表皮需要較高的技巧、較長的時間，表皮一旦撕得不好會造成大量葉肉細胞附著，嚴重影響試驗結果，且觀察到葉肉細胞自發熒光的可能性極高，對定位結果干擾較大。筆者認為，使用打孔器對轉化的煙草葉片進行打孔，或切下5 mm×5 mm的小塊，移至加滿水的0 mL注射器中，用手指堵住出口處，用力抽吸幾下，讓葉片中充滿水，將葉片置于熒光倒置顯微鏡下直接觀察下表皮即可。該方法操作簡便，無需撕取表皮，節省了時間，且觀察時消除了葉肉細胞、自發熒光對定位結果的干擾。浸染法中，對煙草的瞬時表達體系優化為：農桿菌的D600 nm值為06左右，侵染6 min，共培養2 d，在共培養培養基中添加 20 μmol/L 乙酰丁香酮，能得到較高的煙草瞬時表達率。

43以洋蔥為宿主載體

基因槍技術的優點主要是不受宿主限制、受體類型廣泛。該法不僅可以原生質體作為受體材料，而且可以完整細胞、組織等（如葉片、莖或根的切段、幼胚、愈傷組織、花粉細胞等）作為受體材料進行轟擊轉化，可控度高。基因槍轟擊過程中，可根據需要將射彈射入特定層次（位置）的細胞，有利于提高轉化效率。基因槍法的缺陷也是顯而易見的，首先是費用較高，基因槍轟擊對于植物傷害較大，轟擊位置不均勻，細胞容易因為部分受傷害過大而死亡；其次該方法還存在轉化效率低、外源基因向植物中插入不夠精確等缺點。對于基因槍法的優化，不同植物品種之間存在較大差異。例如在水稻中，選用金粉，通過減小射擊距離，轟擊前用甘露醇進行預處理，可以提高轉化率[33]。在小麥中，通過大幅度降低金粉用量，進行滲透壓處理，同時選擇合適的受體，可以提高轉化率[34]。在大豆中，金粉尺寸為06 μm，轟擊時氦壓力值為 00 psi，真空壓力數為27 In·Hg，轟擊距離為9 cm[35]。在玉米中，最佳轟擊參數為： 350 psi氦氣壓力，25 In·Hg真空度，6 cm射擊距離[36]。目前常以洋蔥表皮細胞作為轉化材料，采用農桿菌侵染法，從侵染液中乙酰丁香酮的濃度、農桿菌菌液濃度和侵染時間、共培養時間等方面探索最適轉化條件，但是該方法的不足之處在于對膜蛋白無法做到精準定位，需要使用30%蔗糖繼續進行質壁分離試驗才能進一步驗證定位結果[37]。

5展望

蛋白質的亞細胞定位與其功能發揮密切相關。細胞行使功能需要由特定空間分布的蛋白質種類、含量、修飾的動態變化來體現。隨著多種蛋白質亞細胞定位技術的建立與發展，目前已經實現了從單個蛋白質的亞細胞定位到高通量進行蛋白質亞細胞定位的技術創新，并且從靜態定位研究發展到活體動態研究[38]。各種定位方法的綜合運用積累了大量亞細胞定位數據，使人們了解細胞內不同分區中蛋白質分布的大致輪廓成為可能。近年來，水稻的細胞分區、蛋白質組亞細胞定位研究已經展開[39]。有學者嘗試用熒光共振能量轉移（FRET）顯微測量技術來研究活細胞蛋白質的空間分布，包括對共定位于活細胞特定部位的蛋白質相互作用的研究，以此實時跟蹤特定蛋白質在細胞生長發育過程中的表達、調控機制等[40-4]。蛋白質亞細胞定位數據的積累完善，將為深入闡明蛋白質的功能提供依據。

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