納米金剛石顆粒的襯底增強效應(yīng)研究*

翟陳婷，唐 軍，郭 浩，趙苗苗，郭旭東，劉 俊

(中北大學 儀器科學與動態(tài)測試教育部重點實驗室，電子測試技術(shù)重點實驗室，山西太原030051)

0 引 言

生物熒光標記對生物大分子的研究具有重要的作用［1］，需要熒光材料具有穩(wěn)定的發(fā)光、良好的生物相容性、無毒等特性［2］。

熒光小球、羅丹明、紫藥水等大分子熒光分子是比較常見的熒光標記分子，具有成本低、結(jié)構(gòu)簡單易操作、檢測簡單等特點［3～5］，比利時微電子研究中心首席科學家米諾·納斯拉德克研究小組開發(fā)了一種非入侵式納米科技探測平臺，用于實時監(jiān)測癌細胞內(nèi)部的生物分子活動情況，實現(xiàn)了單細胞膜(單個細胞內(nèi))微區(qū)范圍內(nèi)癌癥細胞發(fā)病跡象的檢測［6］;Fu C C 等人［7］在不均勻環(huán)境中采用熒光探針的方法實現(xiàn)了活細胞中單粒子的定向檢測，然后，由于Alexa Fluor 熒光分子的熒光微弱，導(dǎo)致檢測系統(tǒng)復(fù)雜、分辨率低、靈敏度弱［8］。

金剛石氮空位(nitrogen－vacancy，NV)色心結(jié)構(gòu)由于磁靈敏特性等優(yōu)點，近年來被廣泛地應(yīng)用到生物熒光標記材料［9］，Dr.Ambika Bumb 研究小組采用nm 級熒光金剛石結(jié)構(gòu)實現(xiàn)了對癌細胞的標定和靶向作用檢測，然而需要進一步提高金剛石NV 色心結(jié)構(gòu)的熒光信號相對強度，提高金剛石結(jié)構(gòu)作為熒光標記結(jié)構(gòu)的檢測分辨率［10］。

表面拉曼(Raman)增強效應(yīng)已被廣泛地應(yīng)用于增強分子結(jié)構(gòu)的熒光和Raman 信號，實現(xiàn)對分子信息的高靈敏的檢測表征。研究人員已經(jīng)通過采用不同襯底結(jié)構(gòu)、不同材料、不同納米增強效應(yīng)實現(xiàn)對Raman 和熒光信號的增強［11］，法國Oriane Mollet 小組采用納米結(jié)構(gòu)實現(xiàn)對Raman信號增強，本文采用納米尖端結(jié)構(gòu)實現(xiàn)了準單分子量級的信號增強檢測［12］。

本文研究了不同襯底結(jié)構(gòu)對金剛石NV 色心結(jié)構(gòu)的熒光信號的影響效應(yīng)，采用MEMS 加工工藝技術(shù)制備了不同折射率的Si，SiO2，金屬三種襯底結(jié)構(gòu)，結(jié)合溶膠凝膠工藝制備了納米金剛石結(jié)構(gòu)，并制備到三種襯底結(jié)構(gòu)上，采用Raman 測試研究得到金屬結(jié)構(gòu)對熒光信號的增強效應(yīng)最好，增強因子達到17.71 和15.82，光子壽命也得到了提高，具有明顯的增強效應(yīng)，可實現(xiàn)通過結(jié)合不同折射率結(jié)構(gòu)來實現(xiàn)對熒光標記結(jié)構(gòu)的熒光信號增強，提高熒光標記檢測和識別的分辨率。

1 實 驗

在標準千級潔凈室環(huán)境中，溫度為10 ℃，相對濕度為20%RH，采用MEMS 常規(guī)有機清洗方法準備了單拋(100)晶向、0.51 mm 厚度的n 型Si 片(硼摻雜)、氧化層厚度為(2 850±300)nm 的SiO2片，采用SB—5200DNT 超聲清洗30 min去除片子表面灰塵，采用去離子水沖洗后氮氣吹干備用。

利用英國Mantis 公司的Qprep Deposition System 沉積系統(tǒng)［13］，在Si 片上沉積120 nm 厚的Au 薄膜，設(shè)備真空度為10－8Torr，金靶材純度為99.99%，工藝氣體氬氣純度為99.99%。

實驗所用納米金剛石購買于華晶微鉆有限公司，粒徑尺寸為50 nm，純度大于99.98%，NaSiO3·9H2O 粉末購買于上海國藥集團(GR)，實驗中采用NaSiO3·9H2O 實現(xiàn)對納米金剛石結(jié)構(gòu)的分散［14，15］，防止納米顆粒團簇，并利用超聲波振蕩使顆粒分散得更加均勻。然后，將0.5 mL 的懸浮液滴在Si 片、SiO2片和Au 薄膜上，置于加熱臺80 ℃恒溫加熱60 min 至水分完全蒸干為止。

德國蔡司公司生產(chǎn)的SUPRA55 型掃描電子顯微鏡(SEM)被用于研究表征納米金剛石顆粒的分散和尺寸特性;英國雷尼紹公司的InVia 型Raman 光譜儀表征測試了納米金剛石NV 色性的發(fā)光光譜特性，激發(fā)光波長為514.5 nm，功率為5 mW，曝光時間為10 s。

當激光光子作用于納米金剛石表面，發(fā)生非彈性散射，形成Raman 散射光，引起納米金剛石中分子振動。特定的分子振動頻率對應(yīng)著納米金剛石中特定的價鍵結(jié)構(gòu)。發(fā)光光譜和Raman 光譜之間的關(guān)系［16］如式(1)所示

2 實驗結(jié)果和討論

2.1 納米金剛石的形貌特性

圖1 顯示的是納米金剛石顆粒的SEM 圖，晶粒分布相對比較均勻。通過Smile View 軟件統(tǒng)計［17］得出，90%以上的納米金剛石的尺寸均小于60 nm，最可幾粒徑53 nm，平均粒徑為54.2 nm。納米金剛石沉積在Si 片、SiO2片和Au 片上，形成納米金剛石薄膜，薄膜的附著性良好，沒有開裂、分層現(xiàn)象，說明納米金剛石具有良好的水分散性。

圖1 納米金剛石顆粒的SEM 圖Fig 1 SEM image of diamond nanoparticle

2.2 不同襯底上金剛石NV 色心的Raman 和熒光特性

圖2 (a)是納米金剛石的發(fā)光光譜圖。圖中，曲線(1)、曲線(2)、曲線(3)分別是Si 片、SiO2片和濺射Au 薄膜的Si片上納米金剛石的Raman 曲線。圖2(b)對應(yīng)的是Raman散射光強隨材料不同而變化。

可以看到:在519.9 cm－1處出現(xiàn)了Si 的Raman 本征峰，在1 332 cm－1處出現(xiàn)金剛石的Raman 本征峰。在SiO2和濺射Au 薄膜的Si 片同樣出現(xiàn)納米金剛石的本征峰，且峰位沒有發(fā)生漂移現(xiàn)象。

通過大量實驗統(tǒng)計結(jié)果，得到在Si，SiO2和濺射Au 薄膜的Si 上的Raman 峰強度平均值為27.153，185.489，429.487 kcounts，可以看出:濺射Au 薄膜的Si 片上金剛石的Raman 峰強度約為是Si 和SiO2上的15.82 倍和2.32 倍。

理想的Raman 散射峰比較尖銳，實際上，由于尺寸、缺陷密度、雜質(zhì)以及內(nèi)應(yīng)力等因素，Raman 峰會出現(xiàn)寬化，強度也會下降［18］。在1 332 cm－1出現(xiàn)金剛石本征峰，說明在1 332 cm－1有C—C 鍵的振動，在519.9 cm－1處有Si—Si 鍵振動。

圖3(a)對應(yīng)的是金剛石的熒光光譜圖，圖中曲線(1)、曲線(2)、曲線(3)分別代表Si 片、SiO2片和濺射Au 薄膜的Si 片上納米金剛石發(fā)出的熒光。圖3(b)納米金剛石發(fā)出的熒光強度隨材料的不同變化的熒光強度圖。

圖2 金剛石的發(fā)光光譜圖和不同材料對應(yīng)的Raman 散射光強圖Fig 2 Luminescence spectra of diamond and Raman scattering light intensity corresponding to different materials

能夠看到:納米金剛石在550～800 nm 范圍存在一個發(fā)光帶。在發(fā)光帶上出現(xiàn)了缺陷NV0(575 nm)的發(fā)光峰以及它的伴隨峰(640 nm)。通過大量實驗結(jié)果統(tǒng)計，Si 片、SiO2片和Au 薄膜上金剛石熒光強度分別是128.45，300.98，2 274.33 kcounts，熒光強度增加了2.34，17.71 倍。

產(chǎn)生熒光強度增加的原因可能有:一方面，Si 的折射率(n=3.4)高于金剛石(n=2.4)，而SiO2(n=1.45)和Au 薄膜(1.5～2.0)的折射率都低于金剛石，當激發(fā)光照射時，Si片上一部分光發(fā)生透射，引起光損耗，而SiO2和Au 薄膜發(fā)生全反射。另一方面，Au 薄膜表面的電子發(fā)生振動，形成表面電磁波增強了局域電場，加速了激發(fā)態(tài)的NV 色心釋放光子，從而增強了熒光強度。局部表面等離子體增強效應(yīng)使得電子在導(dǎo)帶和色心缺陷之間發(fā)生轉(zhuǎn)移，導(dǎo)帶中電子濃度增加，使得納米金剛石輻射的光子速率增加，最終導(dǎo)致金剛石熒光強度的增強［19］。

圖3 金剛石的熒光光譜圖和不同材料對應(yīng)的熒光強度圖Fig 3 Fluorescence spectra of diamond and fluorescence intensity corresponding to different materials

2.3 NV 色心的熒光壽命

根據(jù)之前的報道，可以得到塊狀金剛石NV 色心壽命約為14.4 ns，天然金剛石中NV 色心的壽命約為13 ns，合成金剛石中NV 色心的壽命為11.6 ns。塊狀金剛石可以看作介質(zhì)中的一個偶極矩模型［20］，其自發(fā)輻射率Γ

其中，Γ0為自由空間中自發(fā)輻射速率(可視為常數(shù))，n 為介質(zhì)折射率。金剛石的折射率nd為2.4，塊材金剛石壽命τb約為11.6 ns。納米金剛石NV 色心有效的輻射到空氣中和襯底中，襯底上納米金剛石中NV 色心的熒光壽命［20］

其中，fs為襯底所占的體積比(取為1/2)，ns為襯底的折射率。Si，SiO2和Au 的折射率分別取3.42，1.45，1.8時，理論計算得到Si 襯底、SiO2襯底和Au 襯底上納米金剛石NV 色心壽命分別約為12.59，22.73，19.89 ns。納米金剛石中的氮和雜質(zhì)的含量能夠影響NV 色心的熒光壽命，金剛石納米顆粒的尺寸和色心所處的位置和環(huán)境也會對壽命產(chǎn)生影響，因此，得到的壽命有差別。

3 結(jié) 論

本文采用不同折射率的材料與納米金剛相互耦合，實現(xiàn)了對納米金剛石NV 色心的熒光信號增強，基于金屬表面等離子體增強效應(yīng)使得納米金剛石微弱的Raman 和熒光信號分別提高15.82，17.71 倍，使得納米金剛石NV 色心中輻射的光子速率增加，熒光強度大幅度增強，能實現(xiàn)應(yīng)用于提高NV 色心作為熒光載體對生物活細胞的活動軌跡的高靈敏、高分辨率檢測和標定識別。

［1］ 陳中舉，張燕玲，黃金瑛.熒光標記生物大分子及其應(yīng)用［J］.國外醫(yī)學:生物醫(yī)學工程分冊，2004，12(6):348－352.

［2］ Liu K K，Wang C C，Cheng C L，et al.Endocytic carboxylated nanodiamond for the labeling and tracking of cell division and differentiation in cancer and stem cells［J］.Biomaterials，2009，30(26):4249－4259.

［3］ 劉海波，莊峙廈，陳成祥.納米熒光小球標記在蛋白質(zhì)微陣列檢測中的應(yīng)用研究［J］.分析化學，2006，34(9):1227－1230.

［4］ 顏范勇，陳立功，閆喜龍，等.羅丹明類熒光染料的合成及應(yīng)用［J］.化學進展，2006，18(2/3):252－261.

［5］ 劉 萍，鄧承雨，金振國，等.無標記增強型檢測Hg2+的熒光DNA 傳感器［J］.分析試驗室，2013，32(5):61－64.

［6］ 張鈞煒，何巨骉.納米金剛石顆粒有望提前檢測出癌癥跡象［J］.超硬材料工程，2013(4):61.

［7］ Fu C C，Lee H Y，Chen Kowa，et al.Characterization and application of single fluorescent nanodiamonds as cellular biomarkers［J］.Virtual Journal of Biological Physics Research，2007，13(4):727－732.

［8］ 賈書勤，張鳳蘭，丁 衛(wèi).紅外熒光素Alexa Fluor 647 標記的2 型腺相關(guān)病毒保持天然的感染活性［J］.中國生物化學與分子生物學報，2008，24(12):1152－1157.

［9］ Staudacher T，Shi F，Pezzagna S，et al.Nuclear magnetic resonance spectroscopy on a(5－nanometer)3sample［J］.Science，2013，339(6119):561－563.

［10］國際生物公司推出檢測早期癌癥的納米金剛石產(chǎn)品［J］.磨料磨具通訊，2014(8):33.

［11］Oriane Mollet，Aurelien Cuche，Drezet A，et al.Leakage－radiation microscopy of surface plasmon launched by a nanodiamond－based tip［J］.France Diamond and Related Materials，2011，20(7):995－998.

［12］Tang jun，Guo Hao，Chen Meng，et al.Wrinkled Ag nanostructured gratings towards single molecule detection by ultrahigh surface Raman scattering enhancement［J］.Sensors and Actuators B，2015，218:145－151.

［13］翟 超.大面積有序納米結(jié)構(gòu)制備技術(shù)［D］.太原:中北大學，2014.

［14］毛建鋒.納米金剛石分散及應(yīng)用研究［D］.太原:中北大學，2005.

［15］曹建華.金剛石微粉高精度分級技術(shù)研究［D］.保定:華北工學院，2001.

［16］劉曉迪.NV 色心耦合和能量轉(zhuǎn)移機制［D］.合肥:中國科學技術(shù)大學，2013.

［17］Chai Penglan，Liu Jun，Tang Jun，et al.Base effects on fluorescence and surface－enhanced Raman scattering of crystal violet adsorbed on Au nanoparticles surface［J］.Journal of Nanoscience and Nanotechnology，2013，13(2):1011－1016.

［18］葉永權(quán)，匡同春，雷淑梅等.金剛石(膜)的拉曼光譜表征技術(shù)進展［J］.金剛石與磨料磨具工程，2007，161(5):17－21.

［19］Karmenyan A V，Perevedentseva E，Veres M，et al.Simultaneous photoluminescence and SERS observation of nanodiamond at laser deposition on noble metals［J］.Plasmonics，2013，8(2):325－333.

［20］Inam F A，Gaebel T，Bradac C，et al.Enhanced spontaneous emission from nanodiamond colour centres on opal photonic crystal［J］.Quantum Physics，1911(2):1－16.