濁點萃取法在脫脂月見草子中抗氧化成分提取中的應用

劉學，邱香，曹光群，姜曉燕

(江南大學 化學與材料工程學院，江蘇 無錫 214122)

月見草(Oenothera biennis L.)又名夜來香、山芝麻等，為柳葉菜科月見草屬一年生或二年生草本植物［1］。月見草種子含脂肪油20% ～28%，月見草油被譽為“世紀的功能性食品的主角”，受到醫藥、食品保健、美容健膚等領域的廣泛重視［2］。

近年來，從月見草屬植物中分離出脂質、類黃酮、單寧酸、類固醇、三萜烯等化學成分，另外其中還含多酚、生物堿、氨基酸、皂苷等成分［3-5］。據文獻報道，油性成分被提取后的月見草子殘渣中含有強抗氧化性物質，具有很好的開發利用價值［6］。

濁點萃取法(CPE)是一種以表面活性劑的水溶液代替有機溶劑作為萃取劑的新型液-液萃取技術，它利用表面活性劑的增溶和濁點現象而實現高效提取［7］。目前，CPE 已較多的應用于金屬離子、多環芳烴、大分子類物質的富集和分析領域，在天然植物活性成分提取方面的研究相對較少［8-9］。CPE 操作步驟簡單、應用范圍廣、不使用有機溶劑、表面活性劑可回收、活性成分在提取過程中不易變性，且具有易于放大、對環境友好的特點［10-11］。在提取過程中，如果選擇水為主要提取溶劑，同時利用CPE 的這些特性，將有利于開發更具生物活性的產品以及進一步的工業化應用。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

月見草子，河北安國市百味堂藥店;Triton X-110、1，1-二苯-2-苦基肼(DPPH)為阿拉丁試劑;脂肪酸聚醚酯PGPL、EO8 均為自制;氯化鈉、無水乙醇、石油醚(60 ～90 ℃)均為分析純;實驗用水為蒸餾水。

TG1650-WS 離心機;KH-100B 超聲波清洗儀;YLJYE-100 數顯式電熱恒溫水浴鍋;TU-1901 雙光束紫外可見分光光度計;DFY-300 搖擺式高速萬能粉碎機;FA1604 上皿電子天平。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品脫脂 將月見草子用粉碎機粉碎，過40 目標準篩，置于錐形瓶中，加入15 倍量(V/m)的石油醚，超聲提取30 min，常壓過濾。在濾渣中再加入15 倍量的石油醚，重復提取1 次。濾渣40 ℃干燥12 h，得脫脂月見草子粉末。

1.2.2 CPE 提取 準確稱取脫脂月見草子粉末1.0 g于50 mL 錐形瓶中，加入表面活性劑溶液，混合均勻，超聲提取2 次，每次30 min。提取溶液以8 000 r/min轉速離心30 min。將上清液小心轉移至干凈的容器中，合并2 次上清液，加入適量NaCl，再次混合均勻，置于50 ℃水浴中恒溫保持一定時間。繼以6 000 r/min 的轉速離心10 min，溶液清晰分為兩層:下層為水相，上層為表面活性劑富集相。去除水相，表面活性劑富集相中加入15 mL 無水乙醇，充分振蕩搖勻后以6 000 r/min 的轉速離心5 min，將上清液轉移至25 mL 容量瓶中，定容，待測。

1.3 抗氧化活性

1.3.1 清除DPPH 自由基(DPPH·)的反應動力學曲線測定 在10 mL 離心管中依次加入1.0 mL待測樣品溶液和3.0 mL 0.125 mmol/L 的DPPH 溶液，立刻混勻，倒入比色皿中。以1.0 mL 待測樣品溶液和3.0 mL 無水乙醇為參比，在517 nm 處測吸光值隨時間的變化曲線，確定最佳反應時間。

1.3.2 DPPH·清除率測定 (1)在10 mL 離心管中 依 次 加 入 1.0 mL 無 水 乙 醇 和 3.0 mL 0.125 mmol/L的DPPH 溶液，遮光混勻，待反應穩定后，以無水乙醇為參比，在517 nm 處測吸光值，記為A0。

(2)在10 mL 離心管中依次加入1.0 mL 待測樣品溶液和3.0 mL 0.125 mmol/L 的DPPH 溶液，遮光混勻，待反應穩定后，以無水乙醇為參比，在517 nm 處測吸光值，記為A1。

(3)在10 mL 離心管中依次加入1.0 mL 待測樣品溶液和3.0 mL 無水乙醇，遮光混勻，待反應穩定后，以無水乙醇為參比，在517 nm 處測吸光值，記為A2。

自由基清除率(X)，按下式計算:

2 結果與討論

2.1 CPE 提取物清除DPPH·反應動力學

為了解DPPH 反應體系在加入樣品溶液之后的吸光值隨時間的變化規律，可用高濃度和低濃度樣品溶液反應體系進行測定。高濃度體系是指提取物質量濃度在10 ～100 mg/mL，此時清除率均在95%～98%之間波動;低濃度體系是濃度在0.33 ～2 mg/mL，此時清除率隨濃度的增大而升高，呈正向相關性。因此在低濃度范圍內選定一個濃度，比較該樣品濃度下的DPPH·清除率的不同，從而可以以提取物的清除DPPH·能力為指標來判斷萃取能力的高低。動力學曲線反映了CPE 提取物中活性成分與DPPH·反應隨時間的變化趨勢，通過動力學曲線可找出反應達到平衡時所需的時間，結果見圖1。

圖1 CPE 提取物溶液清除DPPH·動力學曲線Fig.1 Kinetic curve of DPPH· scavenging by CPE extract

由圖1 可知，在CPE 提取物溶液作用下，反應體系的吸光度在最初的20 min 內下降較快;20 ～50 min變化趨于平緩;60 min 后吸光度相對穩定，故選擇反應時間為60 min。

2.2 表面活性劑選擇

PGPL 和EO8 分別為在本實驗室以月桂酸和不同比例的環氧丙烷和環氧乙烷反應所得脂肪酸聚氧乙烯酯，具有較低的濁點。以PGPL、EO8 和Triton X-100 三種表面活性劑溶液(40 g/L)進行CPE 提取，各表面活性劑溶液以及所得到提取物的DPPH·清除率的結果見表1。

表1 不同表面活性劑和CPE 提取物的DPPH·清除率Table 1 DPPH· scavenging rates of different surfactants and extracts

由表1 可知，表面活性劑PGPL、EO8 和Triton X-100 清除DPPH·能力極弱，不會對樣品清除DPPH·能力產生干擾。同樣萃取條件下，Triton X-100表面活性劑的DPPH·清除率最高。因此，以下實驗中均選用Triton X-100 作表面活性劑，同時，Triton X-100 作為濁點萃取劑具有濁點溫度低，密度較高，有利于離心分離，價格低廉等優點。

2.3 提取工藝的優化

2.3.1 單因素實驗 各單因素實驗條件下所得提取物的DPPH·清除率見圖2。

由圖2A 可知，隨著平衡時間增長，DPPH·清除率隨之上升，但超過30 min，DPPH·清除率略微下降。這可能是由于當平衡時間過長，會導致濁點萃取向反方向變化，表面活性劑相逐漸消失。故平衡時間30 min 較佳。

由圖2B 可知，隨著液固比的增大，DPPH·清除能力增強，固液比超過30 ∶1 mL/g 后，DPPH·清除率基本穩定。這有可能是因為樣品中的活性物質的量一定，或者受表面活性劑的官能團的種類和數量的限制，再繼續增加萃取液的量，DPPH·的清除率也不會再上升。所以液固比為30 ∶1 較佳。

本實驗選用氯化鈉作為電解質，因其陽離子Na+無鹽溶效應，故陰離子鹽析效應使濁點降低。由圖2C 可知，隨著離子強度的增大，DPPH·的清除率也變大。這是由于對像Triton X-100 這一類的非離子型表面活性劑而言，電解質的加入可以使形成的膠束發生氫鍵斷裂，導致脫水，減小凝聚相體積，并改變主體水相的密度而影響分相速度，從而使濁點溫度降低，表面活性劑分子沉降發生相分離。氯化鈉易溶解，它的加入使Triton X-100 體系在低溫下即能完成相分離。但是當NaCl 的加入量接近飽和溶液時，繼續增大氯化鈉的量對萃取率無影響。所以，實驗中所用離子強度為3.4 mol/L。

圖2 各因素對DPPH·清除率的影響Fig.2 Effects of various factors on DPPH· scavenging rate

由圖2D 可知，隨著表活濃度的增大，DPPH·的清除率增大，40 g/L 時達最大;繼續增大表活濃度，反而會使DPPH·清除率顯著降低，當表活濃度達到55 g/L 時，DPPH·的清除率降低到40%。這可能是由于Triton X-100 的濃度大小不僅決定萃取分離的效果，而且決定富集膠束相體積的大小，同時影響分相過程。濁點萃取率隨表面活性劑中官能團的種類和數量的增多而增大，隨溶液的粘度的增大而減小，當表活濃度＜40 g/L 時，前者起主要作用;當表活濃度＞40 g/L 時，后者起主要作用，故表活濃度在40 g/L 時較優。

2.3.2 正交實驗 在單因素實驗基礎上，采用L9(34)正交實驗，篩選最佳提取工藝條件，結果見表2。

表2 正交實驗結果Table 2 Results of orthogonal experiments

由表2 可知，液固比對清除DPPH·能力影響最大，最后影響因素是表活濃度。最優組合為A2B2C2D3，即平衡時間30 min，液固比30 ∶1 mL/g，離子強度3.1 mol/L，表活濃度45 g/L。

2.4 CPE 提取物與VC 清除DPPH·能力比較

根據正交實驗最優組合的提取條件，提取脫脂月見草子中抗氧化活性物質，定容至10 mL 的容量瓶中，分別稀釋樣品溶液質量濃度至0，0.33，0.67，1.33，2，2.67，4，8，10 mg/mL，測定吸光度，每組濃度都進行3 次平行實驗，求取平均值并計算自由基清除率。精密稱取10 mg VC 定容至10 mL，分別稀釋至質量濃度為0.01，0.015，0.02，0.025，0.03，0.035，0.04，0.06，0.10 mg/mL，按上述方法進行測定。

不同濃度CPE 提取物與VC 清除DPPH·能力見圖3。

由圖3 可知，DPPH·清除率隨著溶液濃度的增加而提高，當DPPH·清除率達到1/2 時，待測樣品半抑制濃度(IC50)為1.065 mg/mL，VC 溶液的IC50為0.017 mg/mL?？梢娒撝乱姴葑覥PE 提取物有較好的抗氧化活性，與強抗氧化劑VC 相比有一定差距，抗氧化成分仍需后續分離純化。

圖3 不同質量濃度VC 和CPE 提取物溶液對DPPH·清除率Fig.3 DPPH· scavenging rate of different concentrations of VC and CPE extracts

3 結論

優化濁點萃取法對脫脂月見草子中抗氧化活性物質的最佳提取工藝條件為:表面活性劑類型Triton X-100、平衡時間30 min，液固比30 ∶1 mL/g，氯化鈉摩爾濃度3.1 mol/L，表面活性劑質量濃度45 g/L。CPE 提取物的IC50值為1.065 mg/mL，具有良好的抗氧化性，將其應用于化妝品、食品或藥品相關領域具有較大的潛力。

［1］ 鄧玉誠，高雅琴，李霞冰.我國東北地區一種值得注意的新藥用植物——月見草(Oenothera biennis L.)［J］.自然資源研究，1982(4):34-37.

［2］ 王麗娟.月見草油的精煉工藝探討［J］.糧油加工與食品機械，2004(7):46-47.

［3］ 韓鳳波，周金梅，于漱琦，等.月見草屬植物化學成分研究進展［J］.農業與技術，2001，21(4):33-36.

［4］ Granica S，Czerwinńska M E，Piwowarski J P，et al.Chemical composition，antioxidative and anti-inflammatory activity of extracts prepared from aerial parts of Oenothera biennis L.and oenothera paradoxa hudziok obtained after seeds cultivation［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2013，61(4):801-810.

［5］ 周秀梅，陳璇.月見草的研究現狀及開發前景［J］.吉林醫藥學院學報，2011，32(6):361-363.

［6］ Peschel W，Dieckmann W，Sonnenschein M，et al.High antioxidant potential of pressing residues from evening primrose in comparison to other oilseed cakes and plant antioxidants［J］.Industrial Crops and Products，2007，25(1):44-54.

［7］ Fang Q，Weung H W，Leung H W，et al.Micelle-mediated extraction and preconcentration of ginsenosides from Chinese herbal medicine［J］.Journal of Chromatography A，2000，904(1):47-55.

［8］ Arain S S，Kazi T G，Arain J B，et al.Determination of nickel in blood and serum samples of oropharyngeal cancer patients consumed smokeless tobacco products by cloud point extraction coupled with flame atomic absorption spectrometry［J］.Environmental Science and Pollution Research International，2014，21(20):12017-12027.

［9］ Gouda A A.Cloud point extraction，preconcentration and spectrophotometric determination of trace amount of manganese (II)in water and food samples［J］.Spectrochimica Acta Part A Molecular and Biomolecular spectroscopy，2014，131:138-144.

［10］劉超，羅晶，馬輝，等.濁點萃取法提取貫葉連翹總黃酮的研究［J］.西北藥學雜志，2006，27(4):296-298.

［11］張慧，許曉菁，楊一青，等.濁點萃取技術及其應用研究進展［J］.化工進展，2012(S1):441-447.