非標記脫氧核酶構象改變熒光法檢測鈾酰離子

曹金秀，王永生

(南華大學 公共衛生學院，湖南 衡陽 421001)

鈾是重要的國防和能源物質，它的日益增長的開發和利用給人類帶來了福音;同時，也增加了人們暴露這種有毒有害物質的風險［1-2］。所以，對環境中鈾污染物進行有效監測是極其重要的。現行檢測鈾酰離子的技術有電化學分析法［3］、光譜分析法［4］、質譜分析法［5］和放射線檢測法［6］等。雖然各有優點，但考慮到環境樣品組分復雜、含量低以及昂貴儀器不宜推廣等因素，本文建立了一種簡便、高特異性和高靈敏度的新方法。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

酶 鏈:5 ’-TCTCTTCAGTTCGGAAACGAACCTTCAGACATAGTGAGTC-3’、底物鏈:5’-CCCCAGTCACTCACTATrAGGAAGAGAT-3’、UO2(CH3CO2)2·2H2O 、MES、SYBR GreenⅠ、焦炭酸二乙酯均為分析純;實驗用水為二次蒸餾水。所有試劑和水均用1‰焦炭酸二乙酯處理。

F-4500 熒光分光光度計;AB204-S 電子分析天平;PB-21 型精密酸度計。

1.2 溶液制備

1.2.1 鈾標準儲備液 準確稱取UO2(CH3CO2)2·2H2O 標準品0.021 4 g，滅菌超純水溶解并定容至50.0 mL 容量瓶中，即得鈾儲備溶液濃度為10－3mol/L。

1.2.2 鈾標準工作液 臨用前用滅菌超純水將鈾標準儲備液逐級稀釋至10－7mol/L。

1.2.3 MES 緩沖溶液(pH 5.5，500 mmol/L) 準確稱取11.560 0 g MES，定容至100 mL 容量瓶，調節pH 為5.5 存儲備用。

1.2.4 SYBR Green Ⅰ(5 ×) 用10 000 ×SYBR Green Ⅰ逐級稀釋得到，備用。

1.3 實驗方法

在2 mL 的EP 管中，依次加入7 μL(5 μmol/L)底物鏈，5 μL(5 μmol/L)酶鏈，10 μL MES 緩沖溶液(pH 5.5)，于95 ℃水浴5 min，室溫放置1 h。在制備的核酸酶(DNAzyme)中加入不同體積的鈾標準溶液，室溫反應40 min，然后加入50 μL SG 溶液(5 ×)，混勻并加水補齊至450 μL，室溫孵育15 min后，置于石英比色皿，于熒光分光光度計進行熒光光譜掃描。光譜測定條件:狹縫寬度均為5 nm，激發波長為497 nm，發射波長為524 nm。

2 結果與討論

2.1 光譜特性

圖1 DNAzyme-SG-UO22+體系的熒光光譜圖Fig.1 Fluorescence spectra of DNAzyme-SG-UO22+ system c UO22+(×10 －8 mol/L)/(1 ～6):0，0.5，1.1，2.7，3.3，4.4

由圖1 可知，DNAzyme-SG 復合物的熒光強度很強(曲線1)，當加入不同濃度的之后，體系的熒光強度逐漸減弱(曲線2 ～6)，且濃度與熒光強度呈良好的線性關系。據此，建立了非標記熒光法檢測的新方法。

2.2 實驗條件優化

2.2.1 MES 緩沖液的pH 值及用量優化 用MES緩沖溶液，研究了pH 4.0 ～6.5 范圍內對體系熒光強度的影響見圖2。

圖2 pH 對體系熒光的影響Fig.2 Effect of pH on the fluorescence

由圖2 可知，pH 由4.0 ～5.5 時，體系的熒光變化值逐漸增加，當pH 為5.5 時，體系的熒光變化值最大。隨后，pH 繼續增加，熒光變化值反而減小，這可能是鈾酰離子與其特異性的DNAzyme 作用對pH有嚴格要求。進一步進行用量優化，實驗表明，加入10 μL MES 能得到較好的ΔF。因此，本實驗選擇10 μL、pH 5.5 的MES 緩沖溶液控制溶液酸度。

2.2.2 SG 用量優化 本體系的檢測信號是由SG染料提供，進行用量優化時在5 ～150 μL 范圍內。隨著SG 用量增加，F 值增加，在加入量為50 μL 時開始出現平臺，說明體系核酸鏈嵌入染料已經飽和，因此，本實驗選用50 μL SG。

圖3 SG 用量對體系熒光的影響Fig.3 Effect of SG on the fluorescence

2.2.3 鈾酰離子作用時間優化 體系的ΔF 隨著鈾酰離子作用時間增加而增強，當達到40 min 時出現平臺期，故實驗選有40 min 為作用時間。

2.2.4 核酸鏈比例優化 為了保證核酸鏈充分形成雙鏈，以及對實驗成本的考慮，對底物鏈和酶鏈比例進行了優化，底物鏈與酶鏈的摩爾比達到7∶5，體系得到較好的ΔF。

2.3 測定方法的選擇性

在優化的最佳實驗條件下，實驗了可能共存的多種離子和物質對體系的影響，當相對標準偏差≤± 5% 時，500 倍Ca2+;200 倍Mg2+;100 倍 的H2PO4－、PO43－、K+、HPO42－、Cu2+、Sr2+、Zn2+、Al3+、Cd2+、Fe2+、Mn2+、Ba2+、Co2+、Cr3+、Tb3+、Cl－、CO22－、SO42－、Hg2+;50 倍Pb2+均不干擾測定，說明該方法選擇性良好。

2.4 測定方法的檢測范圍、檢出限和精密度

在優化出的最佳實驗條件下，鈾酰離子濃度范圍為1.73 ×10－9～4.40 ×10－8mol/L 時，體系的熒光變化值呈現較好的線性關系，線性回歸方程為ΔF=108.99C(×10－8mol/L)+79.22，相關系數r =0.990。根據空白管的標準偏差Sb和標準曲線的斜率k 算出LOD 為5.2 ×10－10mol/L。平行測定11次濃 度 為1.11 × 10－8，2.22 × 10－8，3.33 ×10－8mol/L的鈾酰離子，RSD 依次為2.16%，1.50%和3.10%。

2.5 樣品測定

采集一份鈾礦石浸潤液和一份鈾礦山地表徑流水，將水樣混勻后濾紙過濾，然后再用0.22 μm 針頭式過濾器二次過濾除去雜質。隨后用pH =5.5 MES 緩沖溶液調節體系的pH，加入量為每5 mL 水樣中加入0.5 mL MES 緩沖溶液。樣品中鈾酰離子濃度較大，分別稀釋2 000 倍和1 000 倍，儲存備用;將2 個實際樣品進行測定并做加標回收實驗，結果見表1。

表1 樣品中UO22+檢測結果(n=6)Table 1 Determination results of UO22+ in the samples

3 結論

鈾酰離子特異性識別鈾脫氧核酶，使之在rA 堿基處斷裂，釋放出單鏈，導致SG 從雙鏈DNA 中游離出來，熒光信號發生改變，據此建立了環境水樣中痕量鈾的檢測新方法。新建方法簡便、實用、靈敏度和選擇性高，已用于實際樣品中的測定，結果滿意。

［1］ 商照榮.貧化鈾的環境污染影響及其對人體健康的危害［J］.輻射防護，2005，25(1):56-61.

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