高脂飲食誘導(dǎo)的C57BL/6J幼鼠腎足細(xì)胞中Synaptopodin的表達(dá)及意義

沈 健，臧東鈺，李曉明

遼寧醫(yī)學(xué)院 組織胚胎學(xué)教研室，遼寧錦州 121001；2遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院 胸外科，遼寧錦州121001

高脂飲食誘導(dǎo)的C57BL/6J幼鼠腎足細(xì)胞中Synaptopodin的表達(dá)及意義

沈 健1，臧東鈺2，李曉明1

遼寧醫(yī)學(xué)院 組織胚胎學(xué)教研室，遼寧錦州 121001；2遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院 胸外科，遼寧錦州121001

目的 探討足細(xì)胞骨架蛋白Synaptopodin在高脂飲食所致腎發(fā)育期足細(xì)胞損傷中的表達(dá)及意義。方法 32只3周齡雄性C57BL/6J幼鼠隨機(jī)分為正常飲食組和高脂飲食組，分別給予標(biāo)準(zhǔn)飼料與高脂飼料喂養(yǎng)4周。檢測葡萄糖耐量水平、尿微量白蛋白與尿肌酐；觀察小鼠腎的病理形態(tài)學(xué)改變，應(yīng)用免疫組織化學(xué)和免疫印跡技術(shù)檢測小鼠腎足細(xì)胞中Synaptopodin的表達(dá)變化。結(jié)果 與正常飲食組相比，高脂飲食組小鼠體質(zhì)量顯著增加，葡萄糖調(diào)節(jié)受損，尿微量白蛋白與尿肌酐比率增高。鏡下可見腎小球肥大，腎小囊腔內(nèi)滲出，系膜基質(zhì)輕度增生等病理改變。同時足細(xì)胞Synaptopodin的表達(dá)明顯降低。結(jié)論 Synaptopodin在高脂飲食誘導(dǎo)的C57BL/6J幼鼠腎足細(xì)胞中表達(dá)顯著降低，并出現(xiàn)蛋白尿。

高脂飲食；足細(xì)胞；突觸足蛋白；免疫組化；免疫印跡

兒童期肥胖會增加腎疾病的發(fā)病率，并且在出現(xiàn)高血壓或糖尿病之前就已出現(xiàn)腎功能障礙[1-2]。高脂飲食會引起肥胖并導(dǎo)致體內(nèi)脂質(zhì)和葡萄糖代謝紊亂[3]。而脂質(zhì)和葡萄糖代謝紊亂是許多原發(fā)和繼發(fā)性腎疾病發(fā)生、發(fā)展的的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[4-5]。因此，闡明高脂飲食對發(fā)育期腎損傷的影響及機(jī)制具有重要意義。本研究采用免疫組織化學(xué)技術(shù)及免疫印跡技術(shù)觀察高脂飲食對C57BL/6J幼鼠腎功能、腎組織形態(tài)學(xué)以及腎足細(xì)胞骨架蛋白Synaptopodin表達(dá)的影響，探討Synaptopodin在高脂飲食所致腎發(fā)育期足細(xì)胞損傷中的作用及意義，為進(jìn)一步闡明高脂飲食所致腎損害的發(fā)病機(jī)制提供實驗依據(jù)。

材料和方法

1動物飼養(yǎng) 3周齡雄性C57BL/6J小鼠32只，將小鼠隨機(jī)分為正常飲食組(n=16)和高脂飲食組(n=16)。正常飲食組給予標(biāo)準(zhǔn)飼料，高脂飲食組給予高脂飼料，飼料均購自美國Research Diets公司，喂養(yǎng)4周。各組小鼠分別于飼養(yǎng)0周、1周、2周、3周和4周時稱量體質(zhì)量。飼養(yǎng)4周后進(jìn)行葡萄糖耐量實驗，并收集尿液用于測定尿白蛋白與尿肌酐。

2葡萄糖耐量實驗 實驗前將小鼠禁食16 h，稱重，腹腔注射葡萄糖溶液(2 mg/g)，分別在注射葡萄糖后即刻、15 min、30 min、60 min、90 min、120 min尾部取血，用血糖儀檢測血糖水平。

3ELISA試劑盒檢測尿微量白蛋白與尿肌酐 收集尿液，離心后收集上清。空白孔加樣品稀釋液50μl，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品及待測樣品50μl，室溫孵育120 min。加酶標(biāo)試劑50μl，室溫孵育60 min。加50μl 1×SP conjugate，室溫孵育30 min。加顯色劑至出現(xiàn)明顯的梯度藍(lán)色，待標(biāo)準(zhǔn)孔由藍(lán)色轉(zhuǎn)變成黃色，加終止液終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在450 nm波長下依序測量各孔的光密度(OD值)。

4免疫組織化學(xué)染色 各組小鼠飼養(yǎng)4周后，麻醉(2%戊巴比妥腹腔注射)，4%多聚甲醛行心臟灌流，取腎。右腎入-80℃冰箱中保存。左腎入4%多聚甲醛固定液固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片5μm。石蠟切片脫蠟至水，3% H2O2室溫孵育10 min，枸櫞酸鹽高壓修復(fù)，正常山羊血清封閉。滴加兔多克隆抗體Synaptopodin(1∶200)，4℃過夜，滴加HRP抗兔IgG 37℃孵育。DAB顯色，復(fù)染，脫水，透明，封片。以PBS代替一抗作陰性對照。光學(xué)顯微鏡下觀察并攝片。Synaptopodin蛋白表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)，以出現(xiàn)黃色或棕黃色的細(xì)小顆粒著色為陽性。

5Western blotting測定 取腎組織剪碎，加入裂解液，離心，取上清。灌膠，加樣，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉，兔多克隆抗體Synaptopodin(1∶500)，4℃過夜。二抗室溫孵育，ECL顯色。應(yīng)用FluorchemⅤ2.0系統(tǒng)進(jìn)行光密度測。Synaptopodin蛋白的分子量為74 kU，以目的條帶與內(nèi)參照GAPDH平均吸光度的比值表示蛋白水平，進(jìn)行半定量分析。

6統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)用-x±s表示，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1高脂飲食對小鼠體質(zhì)量的影響 將3周齡的幼鼠分組喂養(yǎng)4周后，可見高脂飲食組小鼠體型偏胖，體毛光澤，其體質(zhì)量較正常飲食組明顯增加(P＜0.05)。見表1。

2葡萄糖耐量實驗 高脂飲食組小鼠葡萄糖負(fù)荷在各時間點的血糖水平明顯高于正常飲食組(P＜0.05)，而且血糖下降水平較為緩慢，表明高脂飲食小鼠喂養(yǎng)4周后葡萄糖調(diào)節(jié)受損。見圖1。

3小鼠尿微量白蛋白/尿肌酐比率 高脂飲食組小鼠的尿微量白蛋白/尿肌酐比率(albumin/creatinine ratio，ACR)明顯高于正常飲食組。見圖2。

4小鼠腎病理形態(tài)學(xué) 與正常飲食組相比，高脂飲食組小鼠腎組織出現(xiàn)了腎小球肥大，腎小囊腔內(nèi)可見滲出，系膜基質(zhì)輕度增生等病理改變。見圖3。

5免疫組化染色 正常飲食組小鼠腎足細(xì)胞中Synaptopodin表達(dá)較強(qiáng)(圖4)。高脂飲食組小鼠腎足細(xì)胞中，Synaptopodin的表達(dá)明顯減弱。見圖5。

6免疫印跡結(jié)果 與正常飲食組相比，高脂飲食組Synaptopodin蛋白的表達(dá)水平明顯下降。見圖6。

圖 1 高脂飲食組和正常飲食組小鼠葡萄糖耐量實驗Fig. 1 Glucose tolerance test of high-fat diet group and normal diet group

圖 2 高脂飲食組和正常飲食組小鼠尿微量白蛋白/尿肌酐比率Fig. 2 Ratio of albumin/creatinine of high-fat diet group and normal diet group

表1 正常飲食組和高脂飲食組小鼠體質(zhì)量比較Tab. 1 Body weight of normal diet and high-fat diet group ()

表1 正常飲食組和高脂飲食組小鼠體質(zhì)量比較Tab. 1 Body weight of normal diet and high-fat diet group ()

aP＜0.05, vs normal diet group

Group (n=16)0 week1st week2nd week3rd week4th week Normal diet10.78±1.3415.86±0.8118.94±1.1221.31±0.8523.60±1.21 High-fat diet10.86±0.8418.39±1.2623.09±1.05a26.49±1.18a28.58±1.07a

圖 3 高脂飲食組小鼠腎HE染色(×1 000)Fig. 3 HE staining in kidney of highfat diet mice (×1 000)

圖 4 正常飲食組小鼠腎Synaptopodin免疫組化染色 (×1 000)Fig. 4 Expression of Synaptopodin in kidneys of normal diet mice by immunohistochemistry (×1 000)

圖 5 高脂飲食組小鼠腎Synaptopodin免疫組化染色 (×1 000)Fig. 5 Expression of Synaptopodin in kidneys of high-fat diet mice by immunohistochemistry (×1 000)

圖 6 正常飲食組和高脂飲食組小鼠Synaptopodin蛋白的免疫印跡分析結(jié)果A:免疫印跡電泳圖； B: Synaptopodin表達(dá)水平Fig. 6 Western blotting analysis of Synaptopodin in kidneys of normal diet and high-fat diet mice A: Electrophoretogram of western blotting; B: Expression level of Synaptopodin

討 論

足細(xì)胞又稱腎小球臟層上皮細(xì)胞，是一種高度特異性的終末分化細(xì)胞，其足突相互交錯覆蓋于腎小球基底膜最外側(cè)，是腎小球濾過膜的最后一道屏障[6]。足細(xì)胞損傷與其骨架蛋白的異常表達(dá)密切相關(guān)。足細(xì)胞骨架蛋白表達(dá)異常會導(dǎo)致足細(xì)胞穩(wěn)定性降低、細(xì)胞間信號傳導(dǎo)障礙及濾過屏障破壞，從而引起蛋白尿及腎功能損害[7-8]。足細(xì)胞骨架蛋白主要包括肌動蛋白(actin)、α-actinin-4和Synaptopodin等[9]。Synaptopodin是一種富含脯氨酸的線狀蛋白，只表達(dá)在腎小球內(nèi)分化成熟的足細(xì)胞和后腦的突觸內(nèi)[10]。研究顯示，Synaptopodin在腎足細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和動力學(xué)等方面發(fā)揮著重要作用[11]。但是目前關(guān)于Synaptopodin在高脂飲食誘導(dǎo)的腎發(fā)育期足細(xì)胞損傷中的作用及意義尚不清楚。

小鼠腎小體于胚齡14 d發(fā)生，生后6周達(dá)到成年水平。因此本實驗以高脂飲食喂養(yǎng)3周齡雄性C57BL/6J幼鼠4周，觀察高脂飲食對幼鼠體質(zhì)量、葡萄糖耐受水平、發(fā)育期腎組織形態(tài)學(xué)以及腎功能的影響。結(jié)果顯示，高脂飲食喂養(yǎng)4周后，小鼠體質(zhì)量增長幅度較正常飲食組小鼠明顯提高，同時出現(xiàn)了葡萄糖耐量受損，說明高脂飲食小鼠出現(xiàn)了肥胖和代謝紊亂的癥狀。Sanad和Gharib[12]對150位肥胖患兒進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)14.7%的患兒出現(xiàn)了微量白蛋白尿，提示肥胖是微量白蛋白尿的重要危險因素。我們的實驗結(jié)果顯示，高脂飲食小鼠出現(xiàn)了尿微量白蛋白排泄率增高。微量白蛋白尿的出現(xiàn)是腎功能受損最敏感的標(biāo)志，因此提示小鼠腎功能已經(jīng)處于早期損傷的階段。此外，HE染色結(jié)果顯示，高脂飲食組小鼠出現(xiàn)腎小球肥大、腎小囊腔內(nèi)滲出以及系膜基質(zhì)輕度增生等表現(xiàn)。高脂飲食組小鼠腎小球病理結(jié)構(gòu)的改變與蛋白尿的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。我們的研究提示，高脂飲食誘導(dǎo)發(fā)育期C57BL/6J小鼠出現(xiàn)了代謝紊亂、腎小球病理改變以及腎功能輕度受損。

足細(xì)胞骨架蛋白Synaptopodin是成熟足細(xì)胞的特異性標(biāo)記物。Synaptopodin與足突的肌動蛋白微絲緊密相連，并與肌動蛋白一同導(dǎo)致足突結(jié)構(gòu)和功能的改變[13-14]。體外培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn)，Synaptopodin基因缺失的足細(xì)胞會形成異常的非極性層狀偽足，導(dǎo)致細(xì)胞遷移受損[15]。Yanagida-Asanuma等[16]認(rèn)為，Synaptopodin通過將足細(xì)胞從運動型轉(zhuǎn)化為收縮型來維持腎小球濾過功能的穩(wěn)定。在本實驗中，我們通過免疫組化及免疫印跡技術(shù)檢測了Synaptopodin在高脂飲食誘導(dǎo)的腎足細(xì)胞中的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，與正常飲食組相比高脂飲食組小鼠腎足細(xì)胞Synaptopodin表達(dá)顯著降低。足細(xì)胞損傷與蛋白尿的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。足細(xì)胞的損傷和丟失會嚴(yán)重破壞腎小球濾過屏障的完整性，促使腎功能發(fā)生損害[17-18]。

綜上所述，高脂飲食誘導(dǎo)的C57BL/6J幼鼠腎足細(xì)胞Synaptopodin的表達(dá)發(fā)生了變化，即表達(dá)顯著降低。足細(xì)胞骨架蛋白Synaptopodin異常表達(dá)可能對足細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響，可能導(dǎo)致足細(xì)胞損傷，繼而引起腎功能損害。但其具體的調(diào)控機(jī)制仍有待深入研究和探討。

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Expression of Synaptopodin in podocytes of high-fat diet C57BL/6J young mice

SHEN Jian1, ZANG Dongyu2, LI Xiaoming1
Department of Histology and Embryology, Liaoning Medical College, Jinzhou 121001, Liaoning Province, China;2Department of Thoracic Surgery, the Third Affliated Hospital of Liaoning Medical College, Jinzhou 121001, Liaoning Province, China

LI Xiaoming. Email: lixiaoming68327@163.com

Objective To investigate the expression and signifcance of Synaptopodin resulting in podocyte injury in high-fat diet C57BL/6J mice. Methods Thirty-two male C57BL/6J mice were randomly divided into two groups. The standard group was fed with basic diet and high-fat diet group was fed with high-fat diet for 4 weeks. Body weight and urine protein changes were measured. nsulin resistance was detected by glucose tolerance test. The kidney tissue morphological changes were examined by HE staining. The expression of Synaptopodin was examined by immunohistochemistry and western blotting. Results In high-fat diet group, the body weight was higher than the standard group, and there was signifcant decrease in glucose tolerance levels and rise in urinary lbumin/ creatinine ratio. HE staining results showed that there were glomeruli hypertrophy, mesangial matrix hyperplasia, and glomerulosclerosis. Compared with standard group, the expression of Synaptopodin in high-fat diet group reduced signifcantly in odocyte. Conclusion The expression of Synaptopodin in podocyte of high-fat diet C57BL/6J mice reduces signifcantly, which may ead to proteinuria.

high-fat diet; podocyte; synaptopodin; immunohistochemistry; western blotting

R 587

A

2095-5227(2015)09-0940-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.09.022

時間：2015-06-15 15:39

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20150615.1539.001.html

2015-04-08

遼寧省高等學(xué)校優(yōu)秀人才支持項目(LJQ2013092)；遼寧醫(yī)學(xué)院校長基金項目(XZJJ20130243)

Supported by the Program for Liaoning Excellent Talent in University(LJQ 2013092)

沈健，男，碩士，主治醫(yī)師。研究方向：腎發(fā)育與疾病。Email: 12090337@qq.com

李曉明，女，博士，教授。Email: lixiaoming68327@163. com