體外沖擊波干預治療對大鼠肌腱損傷修復的觀察

馬 玲，賈子善，肖紅雨，張立寧，戈含笑

解放軍總醫院 康復醫學中心，北京 100853

體外沖擊波干預治療對大鼠肌腱損傷修復的觀察

馬 玲，賈子善，肖紅雨，張立寧，戈含笑

解放軍總醫院 康復醫學中心，北京 100853

目的 探討體外沖擊波干預對大鼠肌腱損傷后組織形態和相關生長因子表達的影響。方法 選擇健康雄性Wistar大鼠43只，隨機分為治療組20只、對照組20只、空白組3只。空白組大鼠不做任何處理，治療組和對照組的40只大鼠制作肌腱慢性跟腱損傷模型。治療組給予損傷跟腱處沖擊波干預治療，沖擊能量為0.16 mJ/mm，沖擊次數3 000；每天治療1次，連續治療1周。對照組不做任何處理。分別在治療后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d處死大鼠，取跟腱組織，光鏡下觀察組織學形態，并采用雙抗夾心ELISA方法進行肌腱組織血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)含量測定。結果 對照組在損傷后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d可以觀察到受損跟腱纖維排列較紊亂，修復過程中再生肌腱纖維不明顯，瘢痕組織形成；治療組經過體外沖擊波治療后1 d、3 d、7 d可以看到受損跟腱組織內膠原纖維排列不規則，跟腱周圍組織充血、水腫；在14 d、21 d時，跟腱內腱細胞的數量開始增多，再生的膠原纖維排列比較整齊，未見明顯瘢痕組織。對照組跟腱組織在傷后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d時VEGF含量逐漸增加，21 d時VEFG含量達到最大；治療組中經沖擊波干預后1 d、3 d、7 d、14 d，VEGF的表達逐漸增高，至14 d時達到最高點，21 d時表達反而減少。結論 體外沖擊干預治療可以改善大鼠損傷肌腱的修復。

體外沖擊波；生長因子；肌腱損傷

肌腱損傷是運動醫學和康復學中的常見病、多發病[1]。在損傷修復過程中，如何促進受損組織的愈合和功能的恢復是個值得研究的課題。既往研究表明，很多生長因子對軟組織損傷(包括肌腱)后的修復均有促進作用[2]。但是目前對肌腱中生長因子的研究較少。體外沖擊波(extracorporeal shock wave therapy，ESWT)療法是利用沖擊波的物理性質對人體的肌肉、骨骼、內臟等組織的病變進行治療的療法[3]。本研究通過制作大鼠肌腱慢性損傷模型，應用體外沖擊波干預治療，對肌腱組織的形態進行觀察并檢測血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)含量，以探討沖擊波治療肌腱損傷的機制。

材料和方法

1實驗動物 由解放軍總醫院動物實驗室提供雄性健康Wistar大鼠43只(取雙后足共86個樣本)，大鼠均為4周齡，平均體質量(200±6.8) g。適應性喂養3 d后，隨機選取3只大鼠作為空白組，另外40只隨機分為治療組和對照組，每組20只。

2實驗儀器和試劑 自制電刺激造模裝置(參考末端病大鼠損傷模型機制建立方法[4])：裝置底部為長約90 cm的平板，平板上放置一排鐵棒，平行排列。裝置四周用鐵皮封閉。將底部的鐵棒用導絲串聯在一起，鐵棒與周圍的鐵皮之間形成絕緣現象，確保不出現導電問題。實驗用VEGF試劑盒購自上海生物制藥有限公司。

3大鼠肌腱慢性損傷造模 通過“電擊跳躍法”建立大鼠肌腱損傷—肌腱慢性損傷動物模型。造模裝置底部連接電源，使相鄰兩個鐵棒之間形成電流，將大鼠的腳同時踩在相鄰兩個鐵棒上固定好，接通外接電，電壓設定在50 V。通過鐵棒電擊大鼠足部，大鼠為了躲避足底電流的強烈刺激，被迫采取向上跳躍姿勢。本研究設定大鼠雙足同時跳離鐵棒為有效跳躍，如只有一足離開，則不算有效刺激。每次通電時間間隔15 s，連續刺激大鼠20 min，休息15 min，再持續刺激20 min。每天進行電刺激1次，每周共刺激6次，持續刺激6周。造模期間，給予大鼠充足的水和純鼠料喂養，保證大鼠營養。造模后檢查大鼠跟腱組織結構，符合慢性跟腱末端病標準為造摸成功。治療組和對照組的所有大鼠進行肌腱損傷造模處理，3只空白組大鼠不做任何處理。

4沖擊波治療 使用項宇醫療型號為XY-KSHOCK MASTER-500的體外沖擊波治療儀，在造模成功后第1天，治療組大鼠行常規麻醉，跟鍵末端區體外沖擊波干預。沖擊能量為0.16 mJ/mm，沖擊次數3 000；每天治療1次，連續治療1周。對照組采用同樣麻醉手段，以排除麻醉等外在因素干擾，但不給予沖擊波干預治療。

5跟腱標本采集及處理 沖擊波干預治療后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d，治療組和對照組分別隨機取4只大鼠雙腿跟腱處組織。空白組3只麻醉處死，取出6個跟腱組織。取材后，用預冷的0.9%氯化鈉注射液清洗，放入4%的多聚甲醛固定液中，4℃固定24 h。放入10% EDTA液脫鈣。入梯度乙醇脫水(75%→85%→95%→100%)，二甲苯透明處理，石蠟包埋。連續切片，脫蠟，乙醇脫水，常規HE染色。

6肌腱組織VEGF含量測定 用“酶聯免疫吸附法”(ELISA)檢測43只大鼠跟腱組織中VEGF含量。

7數據處理 采用SPSS16.0統計軟件進行數據分析，數據采用-x±s表示，組間均數差異比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1造模成功 大鼠跟腱慢性損傷造模。跟腱組織形態學HE染色顯示，腱組織玻璃樣變、肉芽組織增生、血管侵入，膠原纖維致密排列消失，互相融合，折光性增強，染色變差，腱細胞大多消失。符合跟腱慢性損傷模型標準。

圖 1 大鼠跟腱組織(HE染色×400) A：空白組； B：對照組14 d； C：治療組14 d； D：對照組21 d； E：治療組21 dFig. 1 HE staining of tendon tissue in rats A: blank group; B: control group at 14 d; C: treatment group at 14 d; D: control group at 21d; E: treatment group at 21 d

2治療組和對照組在治療前后跟腱組織HE染色比較 對照組在1 d、3 d、7 d、14 d、21 d時受損跟腱纖維排列紊亂，周圍組織充血、水腫，內可見大量的炎性細胞浸潤，肌腱細胞增大，核淡染，再生的肌腱纖維不明顯，可見瘢痕組織形成。治療組1 d、3 d、7 d時可以觀察到受損的跟腱組織內膠原纖維排列不規則，跟部分腱周圍組織充血、水腫，腱細胞核清晰，染色淺，呈現嗜堿性，在14 d、21 d時，跟腱組織出現腱細胞的再生愈合，但愈合情況并不完善，腱細胞數量增多，再生的膠原纖維排列比較整齊，基本未見膠原瘢痕組織的出現。見圖1。

3跟腱組織中VEGF含量表達比較 對照組損傷跟腱組織在傷后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d VEGF表達逐步增高，在21 d時VEGF含量達到最高；治療組干預后1 d、3 d、7 d、14 d VEGF含量逐步增高，至14 d時達到最高點，21 d時表達較14 d時減少，說明治療組的損傷跟腱組織修復較快，在21 d時修復已基本完成。見表1。

表1 兩組大鼠不同時間點跟腱組織處VEGF表達量比較Tab.1 Expression level of VEGF in the tendon tissue of rats in treatment group and control group)

表1 兩組大鼠不同時間點跟腱組織處VEGF表達量比較Tab.1 Expression level of VEGF in the tendon tissue of rats in treatment group and control group)

P＜0.05, vs control group

Group (n=20) VEGF (ng/L) 1 d3 d7 d14 d21 d Control21.2±17.2 52.8±21.4 116.2±31.1 245.5±52.4 382.3±48.4 Treatment 49.1±18.3 88.5±23.3 198.3±30.5 309.5±58.3 248.2±34.2 P0.0020.0030.0150.0070.000

討 論

肌腱損傷臨床上多指發生在肌腱處的疼痛、腫脹和功能障礙等[5]。關于跟腱損傷的發病機制目前認為[6-7]，當跟腱組織自身損傷的同時造成周圍組織的血管等結構受到損傷，使此區域內的血液循環出現障礙，造成跟腱組織結構發生變性、水腫、炎性滲出、無菌性炎癥等變化。

本研究從組織HE染色觀察發現，治療組在治療后1 d、3 d、7 d可以觀察到受損的腱組織內膠原纖維排列不規則，部分跟腱周圍組織充血、水腫，在14 d、21 d時，跟腱組織出現腱細胞的再生愈合，腱細胞數量增多，膠原纖維排列較整齊，未見膠原瘢痕組織，其組織恢復過程比對照組明顯要好。說明沖擊波可以促進肌腱組織內毛細血管的生成、膠原蛋白的合成、成纖維細胞的生成等，其機制可能是沖擊波在大鼠跟腱組織中傳導時，導致作用部位內微循環加速，加速毛細血管的血液循環，增強組織細胞的吸氧能力，從而促進損傷組織修復[8-9]。同時當沖擊波作用于損傷組織時，由于各組織的密度不同，能量在組織中傳遞過程中，可以在不同界面產生不同的機械應力，這種應力可以改變細胞形態，引起組織松解，加速局部微循環。

既往研究發現，VEGF是由肌腱、肌肉等多種組織產生的一種高效的促細胞分裂的細胞因子，在機體組織修復過程中可產生趨化、合成、分泌、增殖等作用；還可增強脂肪、蛋白質和糖原的合成，促進細胞分裂增殖等[2,10-12]。VEGF是血管再生和生長時重要的生長因子，可以加速局部組織內血管的再生，促進受損組織的修復[13-16]。研究證明，VEGF能夠促進肌腱細胞的增殖和基質的合成，通過改善肌腱代謝水平來增強受損肌腱組織的愈合[17-19]。本實驗研究發現，沖擊波干預可以促進損傷肌腱早期VEGF的表達，使其峰值更高，VEGF水平表達的增高可以進一步促進組織的修復程度，21 d時VEGF表達減少，HE染色切片顯示跟腱組織結構比較完整，說明組織損傷后的修復正在進行，沖擊波可加速損傷組織的修復過程。

綜上所述，沖擊波的刺激作用能夠促進受損組織內的生長因子釋放，增加組織內微循環，促進腱細胞的增殖以及細胞外基質的合成，在一定程度上減少或者避免受損組織的粘連，有利于受損組織的修復。因此，體外沖擊波療法可作為治療慢性肌腱損傷的首選療法之一。

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Effect of shockwave treatment on tendon injury in rats

MA Ling, JIA Zishan, XIAO Hongyu, ZHANG Lining, GE Hanxiao
Department of Rehabilitation Medicine, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

JIA Zishan. Email: zwy2pxs@126.com

Objective To evaluate the effect of extracorporeal shock wave therapy on rats with tendon injury. Methods Forty-three male rats were randomly selected and divided into 3 groups: treatment group (n=20), control group (n=20), blank group (n=3). Rats n blank group did not receive any treatment, and tendon injury models were established with rats in treatment and control groups. Rats from treatment group were given extracorporeal shock wave therapy with the power of 0.16 mJ/mm for 3 000 times, once per day for a week, and then rats were sacrifced after treatment for 1 d, 3 d, 7 d, 14 d, 21 d. The tendon tissue were taken and observed under light microscope. Morphology changes and VEGF levels were detected and evaluated by ELISA. Results In control group, he tissue of tendon showed irregular arrangement, the regenerated tendon fber was unapparent, and scar tissue was formed after njury for 1 d, 3 d, 7 d, 14 d, 21 d. While in treatment group, the tissue of tendon was observed with edema and hyperemia and the collagen fber network was destructed after treatment for 1 d, 3 d, 7 d. The tendon cells were regenerating, the collagen fber network howed regular arrangement, and no apparent scar tissue was observed at 14th d, 21th d after treatment compared with control group. The level of VEGF in control group increased gradually after injury for 1 d, 3 d, 7 d, 14 d, and it achieved its maximum at 21th d. In herapy group, the level of VEGF increased at 1st d, 3rd d, 7th d, 14th d after treatment, and it achieved its maximum at 14th d, while t decreased at 21th d. Conclusion Extracorporeal shock wave therapy can improve the repair of injury tendon effectively.

extracorporeal shock wave therapy; growth factor; tendon injury

R 493

A

2095-5227(2015)09-0932-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.09.020

時間：2015-05-27 10:08

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20150527.1008.001.html

2014-12-25

全軍醫學科技青年培育項目(13QNP170)

Supported by the Medical Science and Technique Training Foundation or Youths of the Chinese People's Liberation Army(13QNP170)

馬玲，女，碩士，主管技師。研究方向：康復醫學與理療學。Email: 35209161@qq.com

賈子善，男，主任醫師。Email: zwy2pxs@126.com