紅細胞補體第一受體在乙型慢加急性肝衰竭患者外周血紅細胞中的表達動態觀察

劉曉燕，陳 琰，陳 婧，肖 瓏，童晶晶，關崇丹，嚴立龍

解放軍第302醫院 肝衰竭診療與研究中心診斷與研究，北京 100039

紅細胞補體第一受體在乙型慢加急性肝衰竭患者外周血紅細胞中的表達動態觀察

劉曉燕，陳 琰，陳 婧，肖 瓏，童晶晶，關崇丹，嚴立龍

解放軍第302醫院 肝衰竭診療與研究中心診斷與研究，北京 100039

目的 探討補體第一受體(complement receptor 1，CR1)在乙型慢加急性肝衰竭(hepatitis B virus-acute-on-chronic liver failure，HBV-ACLF)患者外周血紅細胞的動態表達變化及其與預后的關系。方法 入組2013年12月- 2014年6月我院收治的31例HBV-ACLF患者和我科工作人員15例健康對照者(healthy controls，HC)，應用流式細胞術檢測入組人群外周血紅細胞CR1(erythrocyte complement receptor 1，ECR1)的表達量；應用紅細胞天然免疫黏附腫瘤細胞的測定方法檢測ECR1分子黏附活性：以5個或以上紅細胞黏附1個腫瘤細胞為一個結合單位計算黏附率。對HBV-ACLF患者進行為期8周的隨訪，根據臨床療效分為好轉組和無效組，動態觀察2組患者外周血紅細胞CR1變化。結果 ECR1在健康組(62.30±13.22)的表達明顯高于肝衰竭組(41.21±14.33)(t=3.33，P=0.021)；8周后慢加急性肝衰竭患者病情好轉組(47.31±16.36)較無效組(38.99±10.52)表達高(t=1.95，P=0.049)。健康組黏附活性(66.33±16.79)較慢加急性肝衰竭組(45.55±15.04)高(t=5.01，P=0.000)，但8周后不同療效組之間黏附活性無統計學差異。動態觀察結果表明，好轉組患者ECR1表達量及黏附活性呈上升趨勢，而無效組呈下降趨勢或無變化。結論 ECR1表達量及黏附活性與HBV-ACLF患者預后相關，表達增強及黏附活性升高者預后好，動態觀察紅細胞免疫功能具有重要臨床意義。

紅細胞補體第一受體；乙肝病毒；慢加急性肝衰竭

免疫系統功能紊亂是諸多疾病發生、發展的主要機制之一。而補體系統廣泛參與機體抗微生物防御反應及免疫調節，也可介導免疫病理的損傷性反應，是體內具有重要生物學意義的效應系統和效應放大系統。補體C3b是整個反應的關鍵，補體系統被激活后可產生一系列具有重要生物活性的片段，這些活性片段通過與表達在不同細胞表面的特異性受體結合而發揮作用。而紅細胞補體第一受體(erythrocyte complement receptor 1，ECR1)就是其中主要受體之一。在許多免疫損傷疾病中ECR1表達下調，而HBV感染所致慢性肝損傷尤其是慢加急性肝衰竭(hepatitis B virus-acuteon-chronic liver failure，HBV-ACLF)的發病機制與免疫損傷相關，我們考慮在HBV-ACLF患者中可能存在類似改變。因此，我們對健康人群及該類患者的ECR1表達量及黏附活性進行了動態觀察，以探討ECR1在HBV-ACLF患者外周血紅細胞的動態表達變化及其與預后的關系。

對象和方法

1研究對象 選取2013年12月- 2014年6月在我院住院治療的HBV-ACLF患者31例為觀察組，我科工作人員15例為健康對照組。入組的HBVACLF患者需符合2012年《肝衰竭診療指南》中慢加急性肝衰竭診斷標準[1]；排除標準：1)合并感染；2)合并其他自身免疫性疾病。

2療效判定與分組 所有HBV-ACLF患者入院后均接受包括核苷類似物抗病毒治療在內的內科綜合治療，根據治療8周后療效情況分為好轉組與無效組。療效判定標準：癥狀體征好轉，肝功能明顯好轉[谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)及總膽紅素(total bilirubin，TBIL)較原水平下降50%以上]，且無明顯波動者為好轉組，其余判定為無效或死亡。

3臨床指標檢測 所有入組人群均在入院后2 d內留取靜脈血標本實時進行檢測。隨訪者每周留取1次標本，共8次。患者入院及治療8周時均留取膽堿酯酶(cholinesterase，CHE)、球蛋白(globulin，GLB)、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、總膽紅素、凝血酶原活動度(prothrombin activity，PTA)等檢測結果。以上數據均來自解放軍第302醫院臨檢中心。

4流式細胞儀檢測ECR1的表達 藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)標記鼠IgG1和鼠抗人CR1單克隆抗體為美國BD Pharmingen公司產品；0.01 mol/L PBS磷酸鹽緩沖液(pH 7.2 ～ 7.4)為北京索萊寶公司產品。FACS Calibur流式細胞儀為美國BD Pharmingen公司產品。紅細胞花環率實驗用S180小鼠腹水腫瘤細胞購自上海博全爾生物科技有限公司。具體方法：留取抗凝血1 ml。取2支流式試管，取10μl全血加入試管1中，加入5μl PE標記鼠抗人CR1單克隆抗；另1試管為空白對照，加入10μl全血和5μl PE標記鼠IgG1。室溫避光保存15 min；每管加入50μl PBS，混勻，避光15 min，離心、棄上清；PBS漂洗，吸棄上清，沉淀中加入300μl PBS，重懸紅細胞，避光，即刻上機測試。

5紅細胞花環實驗 紅細胞懸液的制備：抗凝劑全血離心(2 000 r/min，離心5 min)備用。腫瘤細胞懸液的制備：將小鼠S180腹水腫瘤細胞用0.9%氯化鈉注射液洗滌1次，配成1×106/ml濃度懸液備用。ECR1黏附活性測定：取血清100μl，紅細胞10μl，腫瘤細胞懸液100μl，混勻，37℃水浴30 min。閱片：取混勻液150μl，加50 ml瑞-吉氏染液混勻懸液涂片，懸浮涂片(玻片的2/3)，分上、中、下；左、中、右9區閱片，每區閱讀10 12個腫瘤細胞，結合5個紅細胞的腫瘤細胞為個結合單位，計算其結合率[2]。

6統計學處理 應用SPSS19.5軟件，計量資料用-x±s表示，組間比較采用成組t檢驗；P＜0.0為差異有統計學意義。

結 果

1一般資料 對照組15例，男性9例，女性6例平均年齡30歲。HBV-ACLF組共31例，男性2例，女性4例，平均年齡46歲。治療8周時在院HBV-ACLF患者根據療效判斷標準評估，19例無效，12例好轉。完成8次隨訪的HBV-ACLF患者共9人。入組人群治療前后檢測指標見表1。

2ECR1在各組間表達比較 用流式細胞術檢測ECR1結果如圖1、圖2所示，ECR1在健康組(62.30±13.22)的表達明顯高于HBV-ACLF組(41.21± 14.33)，兩組有統計學差異(t=3.33，P=0.021)。在HBV-ACLF患者中，8周后病情轉歸不同的患者入組時ECR1表達不同，好轉組(47.31±16.36)較無效組(38.99±10.52)明顯偏高，兩組有統計學差異(t=1.95，P=0.049)，詳見圖1、圖2。

3ECR1在各組間的黏附活性比較 入組時健康組黏附活性(66.33%±16.79%)較慢加急性肝衰竭組(45.55%±15.04%)高，有統計學差異(t=5.01，P 0.000)；在HBV-ACLF患者中，8周后病情轉歸不同的患者在入組時ECR1黏附活性好轉組(47.21%± 26.52%)較無效組(43.72%±28.69%)明顯偏高，但兩組差異無統計學意義(t=0.45，P=0.654)。

4ECR1的表達及黏附活性動態觀察 對完成次隨訪的9例HBV-ACLF患者ECR1表達量及黏附活性進行動態監測，觀察8周時療效。其中例病情好轉，4例無效。如圖3、圖4所示，每個點為該組患者的均值。ECR1表達量及黏附活性在無效組整體表達水平較低，而好轉組隨著病情好轉有上升趨勢。

討 論

CR1表達在許多類型的細胞表面，包括紅細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、T和B淋巴細胞以及樹突狀細胞[3]，與補體C3b及C4b有高度親和性[4]。紅細胞是血液中數量巨大的天然免疫細胞，對于適應性免疫細胞產生的特異疫反應具有重大的生理作用和指導意義[5]。紅細胞中廣泛存在的CR1分子，在數量上雖然僅相當于白細胞膜上CR1分子的1% ～ 2%，但其成簇分布且單位容積血液中紅細胞的數目大于白細胞3個數量級，其與循環免疫復合物、抗原物質及其他機體細胞接觸的機會是白細胞的500 ～ 1 000倍。血液中的CR1 95%表達于紅細胞膜上。紅細胞通過CR1與抗原抗體復合物(immune complex，IC)上的C3b結合，引起紅細胞鈣離子內流，從而引起紅細胞變形性增高，這一現象有助于紅細胞將IC運送到肝、脾固定吞噬細胞[6-7]，ECR1是機體安全有效清除免疫復合物的物質基礎；紅細胞可競爭性地與抗原抗體復合物結合，消除過多抗原抗體復合物造成的免疫抑制，增加淋巴細胞、單核巨噬細胞功能，調節機體免疫功能。紅細胞與各類白細胞構成了人體的天然免疫系統。

表1 入組人群肝功能指標Tab. 1 Clinical data about enrolled patients ()

表1 入組人群肝功能指標Tab. 1 Clinical data about enrolled patients ()

ItemsHealthy groupImproved groupIneffective group Before treatmentAfter treatmentBefore treatmentAfter treatment ALT (U/L)11.9±3.15226.1±431.545.0±21.5326.1±2 311111.1±78.5 AST (U/L)15.22±7.5132.11±169.277.6±101.2161.7±121.935 3221.4±122.5 TBIL (μmol/L)11.28±9.5293.52±142.8127.8±96.9293.52±142.89298.8±147.2 CHE (U/L)8 818.23±179.152 409.67±231.291 216.4±331.72 409.67±231.29984.7±871.1 PA (%)89.14±17.5935.37±11.6845.44±21.235.37±11.6828.5±9.7

圖 1 對照組ECR1的表達Fig. 1 Expression of ECR1 in control group

圖 2 HBV-ACLF患者ECR1的表達Fig. 2 Expression of ECR1 in patients with HBV-ACLF

圖 3 CR1在不同預后HBV-ACLF患者的表達(流式)Fig. 3 Expression of CR1 in patients with HBV-ACLF

圖 4 不同HBV-ACLF患者的紅細胞黏附能力 (花環實驗)Fig. 4 Adhesion activity of ECR1 in patients with HBV-ACLF

有文獻表明[4,8]，正常人紅細胞CR1分子的表達平均值顯著高于肝癌、系統性紅斑狼瘡、大腸癌、卵巢癌以及風濕性心臟病病人。并且CR1分子的數量表達與疾病的病情呈顯著相關性。目前很多抗腫瘤藥物作用靶點也集中于此[9]。肝病的發病機制中免疫不平衡是最重要環節之一。目前還未見ECR1與肝衰竭相關性研究報道。本研究顯示，HBV-ACLF患者外周血ECR1表達量及黏附活性較健康組明顯下降。這一現象說明ECR1與肝壞死密切相關。肝炎性活動初期，肝細胞存在炎性改變或壞死[10]，ECR1發揮清除免疫復合物及免疫調節作用[11]，其數量及黏附活性下降；在此基礎上如果其數量及黏附活性無恢復，將導致肝損傷的進一步加重。通過對HBV-ACLF患者隨訪發現，好轉組患者ECR1在表達量及黏附活性方面都呈上升趨勢，而無效組持續保持低水平狀態。提示隨著炎癥或肝細胞壞死出現ECR1處于消耗狀態，如果短期內可恢復，即紅細胞免疫能力可恢復，意味著預后較好。CR1是調理素受體，可增強吞噬細胞攝取包被了C3b或C4b的顆?；蛭⑸锏哪芰?，促進吞噬且有利于巨噬細胞對抗原信息的傳遞，刺激其他免疫細胞而擴大免疫效應。體外實驗表明，人CR1表達可提高對肺炎鏈球菌的免疫吸附作用，而被ECR1黏附的肺炎鏈球菌可遞呈給巨噬細胞[12]。肝活動性炎癥及病情加重可能與ECR1表達及黏附活性受損導致上述能力受損有關。既往多項研究亦顯示，ECR1分子黏附活性水平持續較低的患者，其病情大多較重、預后較差[12-13]。

目前多項研究結果表明，CR1基因多態性與多種疾病相關[14-15]。在初步明確ECR1在慢性HBV感染患者尤其是HBV-ACLF患者外周血紅細胞的表達及黏附活性改變后，我們將進一步行分子水平研究，以期獲得更多ECR1與慢性HBV感染機制的關系。

1 中華醫學會感染病學分會肝衰竭與人工肝學組， 中華醫學會肝病學分會重型肝病與人工肝學組. 肝衰竭診治指南（2012年版［J］. 中華臨床感染病雜志， 2012， 5（6）： 321-327.

2 王海濱，張景萍，郭峰，等.血細胞天然免疫粘附腫瘤細胞的現象及意義［J］.中華微生物學和免疫學雜志，2001，21（3）：27-30

3 Rochowiak A， Niemir ZI. The structure and role of CR1 complemen receptor in physiology［J］. Pol Merkur Lekarski， 2010， 28（163）79-83.

4 李娟，張卓莉.補體系統與系統性紅斑狼瘡相關性研究進展［J中華風濕病學雜志，2013，17（6）：424-426.

5 房昭， 楊愛蓮， 高福云， 等. 龍葵堿誘導人宮頸癌細胞HeLa凋亡的體外實驗研究［J］. 華西藥學雜志， 2010， 25（3）： 266-268

6 Glodek AM， Mirchev R， Golan DE， et al. Ligation of complemen receptor 1 increases erythrocyte membrane deformability［J］Blood， 2010， 116（26）： 6063-6071.

7 Karnchanaphanurach P， Mirchev R， Ghiran I， et al. C3b depositio on human erythrocytes induces the formation of a membrane skeleton linked protein complex［J］. J Clin Invest， 2009， 119（4）： 788-801

8 王海濱，張景萍，王輝，等.紅細胞CR1分子的定量測定及其臨床意義［J］.中華微生物學和免疫學雜志，2000，20（4）101-104.

9 季宇彬，汲晨鋒.蘆筍多糖對腫瘤小鼠紅細胞離子通道活性的影響［J］.中國食品學報，2014，14（7）：27-31.

10 佘為民.乙型肝炎病毒變異與重癥肝炎關系探討［J］.肝臟2004，9（2）：121-122.

11 Antúnez C， Boada M， López-Arrieta J， et al. Genetic associatio of complement receptor 1 polymorphism rs3818361 in Alzheimer’disease［J］. Alzheimers Dement， 2011， 7（4）： e124-e129.

12 Li J， Wang JP， Ghiran I， et al. Complement receptor 1 expression o mouse erythrocytes mediates clearance of Streptococcus pneumoniae b immune adherence［J］. Infect Immun， 2010， 78（7）： 3129-3135

13 張繼萬，王海濱，周建麗，等.肝炎肝硬化患者紅細胞 CR粘附活性與肝功能損傷程度的相關性研究［J］.傳染病信息2003，16（3）：130-131.

14 Yu X， Rao J， Lin J， et al. Tag SNPs in complement receptorcontribute to the susceptibility to non-small cell lung cancer［J］Mol Cancer， 2014， 13：56.

15 Schmidt C， Wolff M， Von Ahsen N， et al. CR1 is potentiall associated with rate of decline in sporadic Alzheimer’s disease［J］J Clin Neurosci， 2014， 21（10）： 1705-1708.

Expression and clinical signifcance of erythrocyte CR1 in patients with HBV-ACLF

LIU Xiaoyan, CHEN Yan, CHEN Jing, XIAO Long, TONG Jingjing, GUAN Chongdan, YAN Lilong Liver Failure Treatment and Research Center, 302 Military Hospital of China, Beijing 100039, China

Objective To study the expression and clinical significance of erythrocyte CR1 in patients with HBV-ACLF (HBV-acute-on-chronic liver failure). Methods A total of 31 HBV-ACLF patients and 15 healthy controls (HC) were enrolled in this study. Venous blood was extracted from 31 patients with HBV-ACLF and 15 healthy people. Flowcytometry was used to detect the expression of CR1 in patients with HBV infected liver diseases. RBC-C3bRR (RCR) was used for detection of CR1 immunity function. One tumor cell rounded by at least fve red cells was used as a rosette to calculate the ratios. HBV-ACLF patients were followed up for 8 weeks, and then they were divided into improved group and ineffective group according to the clinical effcacy. The changes of ECR1 in peripheral blood in improved group and ineffective group were observed dynamically. Results Our study showed that the expression of ECR1 was signifcantly higher in the control group than in the HBV-ACLF group [(62.30±13.22) vs (41.21±14.33), t=3.33, P=0.021], and the ECR1 expression and adhesion activity in patients with HBV-ACLF was higher in improved group after 8 weeks than in ineffective group [(47.31±16.36) vs (38.99±10.52), t=1.95, P=0.049], while there was no significant difference in adhesion activity between two groups. From dynamic view, expression and adhesion activity of ECR1 showed an increase in improved group, while a decline in ineffective group. Conclusion Expression and adhesion activity of ECR1 are correlated with the prognosis of HBV-ACLF. Patients with increased expression and adhesion activity of ECR1 have a better prognosis. Observation of ECR1 in patients with HBV-ACLF is of great clinical signifcance.

erythrocyte complement receptor 1; hepatitis B viruses; acute-on-chronic liver failure

R 512.62

A

2095-5227(2015)09-0904-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.09.013

時間：2015-06-12 16:45

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20150612.1645.004.html

2014-11-20

劉曉燕，女，博士，主治醫師。研究方向：肝衰竭的基礎與臨床。Email: fmlxy@sina.com

The frst author: LIU Xiaoyan. Email: fmlxy@sina. com